ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA MARCESCENS, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ, ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ОТ ЖИРОВ

ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA MARCESCENS, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ, ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ОТ ЖИРОВ


RU (11) 2310685 (13) C1

(51) МПК
C12N 9/20 (2006.01)
C12R 1/43 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 20.11.2007 - нет данных 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(21) Заявка: 2006107802/13 
(22) Дата подачи заявки: 2006.03.13 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2006.03.13 
(45) Опубликовано: 2007.11.20 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: RU 2148645 C1, 10.05.2000. БАШКАТОВА Н.А. и др. Влияние условий культивирования на биосинтез липазы у serratia marcescens. - Микробиология, 1979, т.68, вып.5, с.826-832. Bashkatova N.A. and et. Isolation of the intracellular lipase of serratia marcescens, Microbiologia, 1979, Nov-Dec., 48(6):994-998. GaoL., and et., Optimization of serratia
marcescens lipase production for enantioselective hydrolysis of 3-phenylglycidic acid ester, Ind Microbiol. Biotechnolol., 2004, Dec; 31(11):525-530. Abdou AM., Purfication and partial characterization of psychrotrophic serratia marcescens lipase., J. Daily, Sci., 2003., Jan; 86(1):127-132.

(72) Автор(ы): Логинов Олег Николаевич (RU); Паканещикова Наталья Владимировна (RU); Силищев Николай Николаевич (RU); Галимзянова Наиля Фауатовна (RU); Бойко Таисия Филипповна (RU) 
(73) Патентообладатель(и): Закрытое акционерное общество научно-производственное предприятие "Биомедхим" (ЗАО НПП "Биомедхим") (RU) 
Адрес для переписки: 450071, г.Уфа, ул. Менделеева, 213/1, ЗАО НПП "Биомедхим", Р.М. Шайнурову 

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA MARCESCENS, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ, ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ОТ ЖИРОВ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности, в очистке сточных вод. Штамм бактерий Serratia marcescens KM ИБ УНЦ РАН ИБ 2-2 - продуцент липазы. Изобретение позволяет повысить выход липазы. 1 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма бактерий - продуцента фермента липазы.

Липазы катализируют гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот и глицерина. Пищевые предприятия загрязняют окружающую среду стоками, содержащими высокие концентрации растительных и животных жиров. Поиск новых штаммов микроорганизмов - продуцентов липазы, проявляющих активность по деструкции жиров растительного и животного происхождения, является актуальной задачей.

Основными продуцентами липаз являются штаммы грибов Rhizopus [1, 2], Fusarium [3], некоторые дрожжи (Jarrowia) [4]. Известен, например, штамм грибов Fusarium oxysporum - продуцент липазы [3]. Данный штамм выращивают при температуре 30°С в течение 150-200 часов на питательной среде, содержащей, г/л:

MgSO4·7H 2O 0,5 
КН2PO4 1,0 
NaNO3 3,0 
Пептон 30,0 
Дрожжевой экстракт 1,0 
Оливковое масло 10,0 


Через 150 часов культивирования достигается максимальное накопление в культуральной жидкости специфической липазной активности - 150 ед.акт./мг биомассы (по сухому весу). Недостатком известного штамма является длительность культивирования (6-7 суток), сложность питательной среды и трудоемкость процедуры получения культуральной жидкости (освобождение от грибного мицелия).

Использование бактерий-продуцентов липаз обладает по сравнению с грибами преимуществом, заключающимся в ускорении процесса культивирования. Это может сделать более выгодным технологический процесс получения липазы. Известен, например, штамм Serratia marcescens 345 [5], который выращивают при температуре 30°С на питательной среде (рН 7,0), содержащей, г/л:

Отвар соевой муки 50,0 
Мочевина 0,1 
MgSO4·7H 2O 0,1 
KH2PO4 0,2 


Через 24 часа в культуральной жидкости накапливается максимальное количество липазы со специфической активностью 95 ед.акт./мг биомассы (по сухому весу). Недостатком данного штамма является низкая специфическая активность продуцируемого фермента.

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом является штамм Serratia marcescens В-10 L-1 [6], который выращивают при температуре 28-30°С на питательной среде (рН 7,0), содержащей, г/л:

MgSO4·7H 2O 0,25 
КН2PO4 3,0 
Na2HPO 4·2H2O 7,0 
NH4Cl 1,0 
CaCl2·2H 2O 0,02 
NaCl 0,5 
Отвар соевой муки 50,0 


Максимальное накопление липазы характеризуется величиной, составляющей 800 ед.акт./мг биомассы (по сухому весу).

Недостатком данного штамма является сравнительно низкая специфическая активность продуцируемого фермента.

Технической задачей изобретения является получение нового бактериального штамма, обеспечивающего более высокий выход липазы, проявляющей активность по деструкции твердых жиров животного и растительного происхождения.

Поставленная задача достигается предлагаемым штаммом Serratia marcescens ИБ 2-2, выделенным из образца сточных вод, отобранного в аэротенке биологических очистных сооружений пермского мясокомбината. Штамм поддерживается в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН. Штамм Serratia marcescens ИБ 2-2 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки палочковидные, прямые, размером 0,5-0,8?1,0-3,0 мкм, подвижные, одиночные, парные или в цепочках, спор не образуют. Грамотрицательные.

Морфологию колонии определяли после 4-5 суток роста при 28°С. На мясопептонном агаре (МПА) - круглые с ровными краями, гладкие, слегка выпуклые, непрозрачные, блестящие, кремовые, мягкой консистенции колонии, диаметр 3-5 мм.

Физиологические и биохимические признаки. Штамм является факультативным анаэробом, обладает и дыхательным и бродильным типами метаболизма, не требователен к факторам роста. Оптимальная температура роста 28-30°С, растут при 5°С и 40°С. Разжижает желатин, пептонизирует и свертывает молоко, гидролизует лецитин. Способен расти на среде Симмонса с цитратом, реакция Фогеса-Проскауэра положительная. Проба с метиловым красным положительная. Дает отрицательный оксидазный, положительный каталазный тесты. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, ксилозу, арабинозу, сахарозу, маннозу, галактозу, фруктозу, лактозу, мальтозу, крахмал, сорбитол, ацетат. Растет на МПА с 8% NaCl.

Штамм хранится на косяках МПА в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильно-высушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Анализ штамма путем секвенирования двух фрагментов гена 16S РНК и последующее сравнение этих фрагментов со всеми известными последовательностями, депонированными во Всемирной базе генов (GenBank), подтвердили достоверность идентификации.

Для культивирования штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 с целью получения липазы применяют питательную среду следующего состава, г/л: соевая мука - 5; дрожжевой экстракт - 60; К 2НРО4 - 5,0; (NH4 )2SO4 - 1,0.

Количество накапливаемой биомассы штамма ИБ 2-2 определяют путем подсчета числа жизнеспособных клеток в культуральной жидкости. Для этого методом посева определяют титр бактерий в 1 мл культуральной жидкости и пересчитывают его в мг биомассы (по сухому весу), исходя из того, что 109 клеток бактерий весит 0,28 мг [6].

Активность липазы определяют следующим образом. К реакционной смеси, содержащей 4,5 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 8,0) и 5 мл 40%-ной эмульсии оливкового масла в 2%-ном поливиниловом спирте приливают 0,5 мл супернатанта культуральной жидкости. Тест-пробу инкубируют в течение 30 мин при температуре 37°С, после чего добавляют 10 мл смеси этанол: ацетон (1:1). Степень расщепления оливкового масла определяют, оттитровывая продукты гидролиза раствором гидроокиси натрия (0,05 М NaOH), в присутствии 1%-ного тимолфталеина, до возникновения голубой окраски. Контрольную пробу обрабатывают аналогично тест-пробе, но липазу вносят непосредственно перед титрованием. Специфическую активность липазы выражают в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 час при гидролизе субстрата 1 мл культуральной жидкости, в пересчете на количество биомассы, содержащейся в 1 мл культуральной жидкости. Расчет специфической липазной активности (ЛА), в ед. акт./мг биомассы (по сухому весу), производят по формуле:

ЛА=(V-Vk) ·K/t·V E·C,

где V - количество 0,05 М NaOH, израсходованного на титрование тест-пробы, мл;

Vk - количество 0,05 М NaOH, израсходованного на титрование контрольной пробы, мл;

К - количество олеиновой кислоты, оттитровываемое 1 мл 0,05 М NaOH (К=50), мкмоль;

t - время реакции, час;

VE - объем культуральной жидкости, добавляемой к реакционной смеси, мл;

С - концентрация биомассы (по сухому весу), мг/мл.

Результаты определения липолитической активности культуральной жидкости, полученной при культивировании штамма Serratia marcescens ИБ 2-2, приведены в таблице. Эти данные свидетельствуют о высокой активности липазы, продуцируемой предлагаемым штаммом микроорганизмов. Так, максимальная специфическая активность фермента штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 составляет 1018 мкМ олеиновой кислоты/ мг биомассы, что в 1,27 раза превышает величину максимальной специфической активности (800 ед. акт./мг биомассы) штамма по прототипу.

Способность липолитических ферментов, продуцируемых штаммом Serratia marcescens ИБ 2-2, к деструкции твердых жиров растительного и животного происхождения определяли следующим образом.

Пример 1. Утилизацию кулинарного жира проводят путем периодического выращивания штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 в колбах на качалке (200 об/мин), объем среды 100 мл. Состав питательной среды: соевая мука - 5; дрожжевой экстракт - 60; К2HPO4 - 5,0; (NH4)2SO 4 - 1,0; рН среды 7,0, температура выращивания 28°С. Время выращивания 40 час. Исходное содержание кулинарного жира составляет 1 мас.%. Оценку роста бактерий проводили микроскопированием на твердой (агаризованной) питательной среде. Степень деструкции твердых жиров определяли весовым методом с использованием процесса экстракции. По окончании процесса ферментации штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 титр бактерий в культуральной жидкости составил 3,0·109 КОЕ/мл, а деструкция кулинарного жира - 100%.

Пример 2. Аналогично примеру 1 утилизацию свиного жира проводят путем периодического выращивания штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 в колбах на качалке при параметрах процесса и составе питательной среды, приведенным в примере 1. Время выращивания 40 часов. Исходное содержание свиного жира составляет 1 мас.%. По окончании процесса ферментации штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 титр бактерий в культуральной жидкости составил 4,0·109 КОЕ/мл, а деструкция свиного жира - 100%.

Пример 3. Аналогично примеру 1 утилизацию говяжьего жира проводят путем периодического выращивания штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 в колбах на качалке при параметрах процесса и составе питательной среды, приведенном в примере 1. Время выращивания 51 час. Исходное содержание говяжьего жира составляет 1 мас.%. По окончании процесса ферментации штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 титр бактерий в культуральной жидкости составил 3,0·109 КОЕ/мл, а деструкция говяжьего жира - 100%.

Результаты экспериментов, приведенные в примерах 1-3, свидетельствуют о высокой эффективности процесса биодеструкции твердых жиров животного и растительного происхождения под действием липолитических ферментов, продуцируемых штаммом Serratia marcescens ИБ 2-2.

Результаты экспериментов, приведенные в примерах 1-3, свидетельствуют о высокой эффективности процесса биодеструкции твердых жиров животного и растительного происхождения под действием липолитических ферментов, продуцируемых штаммом Serratia marcescens ИБ 2-2.

Таким образом, получен штамм Serratia marcescens ИБ 2-2, обладающий высокой липолитической активностью, который может быть использован в качестве основы биопрепарата для биологической очистки сточных вод или канализационных систем от жиров.

Список литературы

1. А.с. СССР 1581742 А1, опубл. 30.07.90.

2. А.с. СССР 1726513 А1, опубл. 15.04.92.

3. Р.Rapp. Production, regulation and some properties of lipase activity from Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum // Enzyme and Microbial Technology. - 1995. - V.17. - P.832-838.

4. А.с. СССР 1454852 А1, опубл. 30.01.89.

5. Башкатова Н.А., Северина Л.О. Влияние условий культивирования на биосинтез липазы у Serratia marcescens // Микробиология. - 1979. - Т.68, вып.5. - С.826.

6. Патент RU 2148645 С1, опубл. 10.05.2000.

Липолитическая активность штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 
Время культивирования, ч Липолитическая активность, мкМ олеиновой кислоты/мг биомассы (по сухому весу) 
Штамм Serratia marcescens ИБ 2-2 Штамм Serratia marcescens В-10 L-1 (по прототипу) 
5 0 91 
10 53 800 
15 188 300 
20 393 160 
25 446 42 
30 1018 31 
35 439 30 
40 188 30 
50 30 30 





ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Штамм бактерий Serratia marcescens KM ИБ УНЦ РАН ИБ 2-2 - продуцент липазы.





ПРОЧИТАТЬ НУЖНО ВСЕМ !
Судьба пионерских изобретений и научных разработок, которым нет и не будет аналогов на планете еще лет сорок, разве что у инопланетян



Независимый научно технический портал
Воздухо- и водоочистка. Опреснительные установки






СОВЕРШЕННО БЕСПЛАТНО!
Вам нужна ПОЛНАЯ ВЕРСИЯ данного патента? Сообщите об этом администрации портала. В сообщении обязательно укажите ссылку на данную страницу.


ПОИСК ИНФОРМАЦИИ В БАЗЕ ДАННЫХ


Режим поиска:"и" "или"

Инструкция. Ключевые слова в поле ввода разделяются пробелом или запятой. Регистр не имеет значения.

Режим поиска "и" означает, что будут найдены только те страницы, где встречается каждое из ключевых слов. Например, при запросе "очистка воды" будет найдено словосочетание "очистка воды". При использовании режима "или" результатом поиска будут все страницы, где встречается хотя бы одно ключевое слово ("очистка" или "воды").

В любом режиме знак "+" перед ключевым словом означает, что данное ключевое слово должно присутствовать в найденных файлах. Если вы хотите исключить какое-либо слово из поиска, поставьте перед ним знак "-". Например: "+очистка -воды".

Поиск выдает все данные, где встречается введенное Вами слово. Например, при запросе "сток" будут найдены слова "стоков", "стоки" и другие. Восклицательный знак после ключевого слова означает, что будут найдены только слова точно соответствующие запросу "сток!".


Устройства и способы водоочистки | Опреснительные установки. Дистилляторы | Устройства и способы воздухоочистки


Рейтинг@Mail.ru