ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas alcaligenes, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ГРУНТОВЫХ И ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД ОТ ТРИНИТРОТОЛУОЛА

ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas alcaligenes, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ГРУНТОВЫХ И ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД ОТ ТРИНИТРОТОЛУОЛА


RU (11) 2292392 (13) C2

(51) МПК
C12N 1/20 (2006.01)
C02F 3/34 (2006.01)
B09C 1/10 (2006.01)
C12R 1/40 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.12.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(21) Заявка: 2004137584/13 
(22) Дата подачи заявки: 2004.12.23 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.12.23 
(43) Дата публикации заявки: 2006.06.10 
(45) Опубликовано: 2007.01.27 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: RU 2001111823 С2, 10.05.2003. RU 2037523 C1, 19.06.1995. RU 2228953 С2, 20.05.2004. EP 1132462, 12.09.2001. US 5656169, 12.08.1997. 
(72) Автор(ы): Воробьев Алексей Владимирович (RU); Марченко Анатолий Иванович (RU); Руднева Ольга Александровна (RU); Дядищев Николай Романович (RU) 
(73) Патентообладатель(и): Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (НИЦ ТБП) (RU) 
Адрес для переписки: 142253, Московская обл., Серпуховский р-н, п/о Дашковка, ул. Ленина, 102А, НИЦ ТБП 

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas alcaligenes, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ГРУНТОВЫХ И ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД ОТ ТРИНИТРОТОЛУОЛА
Изобретение относится к микробиологии в частности для получения биопрепарата для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод при попадании в окружающую среду тринитротолуола. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes BS300 выделен из почвы, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, под номером В-8810. Данный штамм утилизирует тринитротолуол. Устойчивость штамма к ионам тяжелых металлов расширяет диапазон его применения при очистке почвы и воды от комбинированного загрязнения тринитротолуолом и металлами. Штамм Pseudomonas alcaligenes BS300 продуцирует биологические поверхностно-активные вещества, что ускоряет деградацию тринитротолуола в водной среде и почве. 5 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм, который может быть использован для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод при попадании в окружающую среду тринитротолуола (ТНТ).

2,4,6-тринитротолуол (ТНТ) производится нитрованием толуола в промышленных масштабах с конца 19 века во многих странах. Он используется в качестве взрывчатого вещества в военных и промышленных целях. ТНТ был обнаружен в сточных водах, поверхностных и почвенных водах, в почве и осадках вблизи предприятий его производящих. Загрязнение окружающей среды ТНТ представляет серьезную угрозу здоровью населения и природе. ТНТ мало растворим в воде, хорошо адсорбируется на минералах глины и гуминовых веществах почвы и очень медленно переходит в водную фазу, где его метаболизируют микроорганизмы.

Известны штаммы микроорганизмов: Penicillium sp. [1], Phanerochaete chrysosporium [2], Pseudomonas fluorescens I-C [3], Clostridium thermoaceticum [4], Pseudomonas savastanoi [5], Rhodococcus (opacus) erythropolis HL PM-I [6], Desulfovibrio sp. (B stram) [7], Enterobacter cloacae PB2 [8], Anabena sp. [9], Pseudomonas putida [10], которые могут разлагать ТНТ в почве и воде. Наиболее близким предлагаемому штамму является штамм бактерий Pseudomonas putida [10], обладающий высокими характеристиками по биодеградации ТНТ. Однако недостатком этого штамма является то, что для усиления биодеградации ТНТ необходимо добавлять поверхностно-активные вещества.

Задачей изобретения является получение нового штамма микроорганизмов, обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению к ТНТ, продуцирующего внеклеточные биологические поверхностно-активные вещества (биосурфактанты), который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных ТНТ и солями тяжелых металлов.

Предлагаемый штамм Pseudomonas alcaligenes BS300 выделен из почвы, загрязненной ТНТ, и селекционирован путем пересевов отдельных колоний бактерий на чашках с минимальным агаром А, который содержит (г/дм3) Na2HPO 4·Н2O - 6,0; КН 2PO4 - 3,0; NaCl - 0,5; NH 4Cl - 1,0; Mg2SO4 ·7H2O - 0,3; CaCl2 ·2H2O - 0,01; Агар-агар - 15,0; пируват натрия - 5 г, ТНТ - 100 мг. Вода дистиллированная - до 1 дм 3; рН - 7,2.

Штамм Pseudomonas alcaligenes BS300 идентифицирован в соответствии с определителем Берга [12] и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ В-8810.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфологическими и физиолого-биохимические признаками. Грамотрицательные подвижные палочки размером 2-3·0,6-0,8 мкм, спор не образует. На агаризованной питательной среде из кислотного гидролизата рыбной муки на вторые сутки образуются плоские, матовые колонии диаметром 2-3 мм. В бульоне из кислотного гидролизата рыбной муки растет в виде пленки и равномерного помутнения.

Штамм является аэробом, обладает оксидазной и каталазной активностью, растет в температурном диапазоне от 8 до 41°С, оптимум от 26 до 28°С. В качестве источника углерода потребляет ацетат, цитрат, сукцинат, аланин, аргинин. Обладает аргининдигидролазной активностью, восстанавливает нитраты, денитрификационная активность отсутствует. Прототроф, в дополнительных факторах роста не нуждается. Гидролизует желатин, обладает лецитиназной и уреазной активностью. Не гидролизует крахмал и поли- -оксибутират.

Штамм трансформирует ТНТ кометаболически в присутствии цитрата, сукцината.

Штамм не патогенен (не вирулентен, не токсичен, токсигенностью не обладает).

Проверка на патогенность проведена на белых мышах и белых крысах. На штамм оформлено заключение о безопасности.

Генетические особенности. Культура устойчива к антибиотикам ампициллину. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлов: Pb, Zn, Fe, Cr, Co - 50 мг/дм 3.

Штамм продуцирует биологические поверхностно-активные вещества (биосурфак-танты). Штамм хорошо растет на богатых питательных средах на основе мясопептонного бульона и ферментативного гидролизата рыбной муки, на синтетических питательных средах, где в качестве источника углерода используются сахароза, пируват, меласса.

Условия хранения: в лиофилизированном состоянии в ампулах при 4°С. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на агаризованной питательной среде, (г/дм 3): Na2HPO4 ·Н2О - 6,0; KH2 PO4 - 3,0; NaCl - 0,5; Mg 2SO4·7Н2 О - 0,3; CaCl2·2H2 O - 0,01; (NH4)2SO 4 - 0,25; агар-агар - 15,0; сахароза - 5 г; ТНТ - 50 мг; вода дистиллированная - до 1 дм3; рН - 7,2.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes BS300 выращивают на минеральной среде следующего состава, г/л: Na 2HPO4·Н2 O - 6,0; КН2PO4 - 3,0; NaCl - 0,5; Mg2SO4 ·7Н2О - 0,3; CaCl2 ·2H2O - 0,01; (NH4 )2SO4 - 0,25; агар-агар - 15,0; сахароза (или меласса) - 5; вода дистиллированная - до 1 дм3; рН - 7,2. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл питательной среды и 0,1% ксенобиотика (ТНТ) отдельно в каждую. Колбы засевают клетками предлагаемого штамма в концентрации 1,0·107 м.кл/см3 . В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, ТНТ и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в пяти повторностях. Колбы культивируют на качалке при 200 об./мин в течение 2,5 суток. Кометаболическую биодеградацию ТНТ определяют с использованием жидкостной хроматографии высокого давления. Данные эксперимента показывают, что предлагаемый штамм через 48 часов утилизирует 88% ТНТ, тогда как на среде без сахарозы или мелассы в качестве источника углерода биодеградации ТНТ не установлено.

Пример 2. В колбы на 100 см 3 вносят по 30 см3 синтетической среды (состав среды указан в примере 1), ТНТ из расчета 100 мг/л, 20 мг/л солей Pb, Zn, Fe, Cr, Co - 40 мг/дм3 , Hg - 86 мг/дм3 и клетки штамма Pseudomonas alcaligenes BS300 в концентрации 1,0·10 м.кл/см 3. Контролем служит засеянная колба с ТНТ. Исследуемые колбы культивируют в пяти повторностях на качалке при 28°С и 200 об./мин в течение 2 суток. Результаты эксперимента показывают, что эффективность деградации ТНТ предлагаемым штаммом в вариантах с солями металлов и без них не отличается (таблица 1).

Таблица 1 
Биодеградация ТНТ в присутствии тяжелых металлов штаммом Pseudomonas alcaligenes BS 300, % (M±m) 
Вещество Биодеградация 
С металлами Без металлов 
ТНТ 80,0±5,6 78,2±5,9 
Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95% 


Пример 3. Культуральную жидкость штамма Pseudomonas alcaligenes BS300, выращенного, как в примере 1, отделяют от микробных клеток центрифугированием при 5000 об./мин в течение 10 минут. В качестве биосурфактантсодержащей жидкости в опыте используют культуральная жидкость, разведенную дистиллированной водой в 10 раз. Поверхностное натяжение этой жидкости определяют с использованием кольцевого тензиометра. Контролем служит дистиллированная вода. Результаты определения поверхностного натяжения показывают (таблица 2), что добавление культуральной среды в дистилированную воду приводит к снижению поверхностного натяжения дистиллированной воды с 53,1 дин/см до 26,4 дин/см. Добавление незасеянной питательной среды в таком же соотношении 1:10 не оказывает влияния на поверхностное натяжение дистиллированной воды. Таким образом, культуральная жидкость предлагаемого штамма содержит биологические поверхностно-активные вещества.

Таблица 2 
Влияние биосурфактантобразующей культуральной жидкости штамма Pseudomonas aicaligenes BS300 на поверхностное натяжение дистиллированной воды, дин/см (М±m) 
Исследуемая жидкость Поверхностное натяжение 
Дистиллированная вода 56,1±4,2 
Биосурфактантсодержащая жидкость 28,4±3,3 
Дистилированная вода + питательная среда 53,1±2,6 
Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95% 


Пример 4. В колбы на 100 см3 вносят по 27 см 3 минеральной среды (состав среды указан в примере 1) и ТНТ из расчета 100 мг/л. В колбы добавляют по 3 см 3 биосурфактантсодержащей культуральной среды как в примере 3. Колбы засевают культурой Pseudomonas alcaligenes BS300 до концентрации 1,0·10 КОЕ/см3. В качестве контролей используют колбы с ТНТ. Культивирование проводят на качалке при 200 об./мин, температуре 20°С в течение 3 суток. Эффективность биодеградации ТНТ определяют методом жидкостной хроматографии высокого давления. Результаты экспериментов показывают (таблица 3), что добавление биосурфактанта повышает эффективность биодеградации ТНТ. Так, за 2 суток в вариантах опыта с добавлением биосурфактанта биодеградация ТНТ прошла на 100%.

Таблица 3 
Биодеградация тринитротолуола штаммом Pseudomonas alcaligenes BS300 при добавлении биосурфактанта, % (М±m) 
Вещество Биодеградация, % 
Биосурфактант добавлен Без биосурфактанта 
ТНТ 100% 62,2±5,8 
Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95% 


Пример 5. В эксикаторы объемом 3 дм3 вносят 2 кг дерново-подзолистой почвы, загрязненной 0,1% по массе ТНТ, и тщательно перемешивают.

Суспензию бактерий штамма Pseudomonas alcaligenes BS300 разводят фосфатным буферным раствором рН 7,2 и вносят в почву, загрязненную ксенобиотиком из расчета 1,0·10 7 КОЕ на 1 г почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60% от общей влагоемкости и экспонируют при 20°С в течение 2 месяцев. Для анализа образцы почвы отбирают в момент начала эксперимента и через 2 месяца. Эффективность биодеградации ТНТ предлагаемым штаммом в почве оценивают методом жидкостной хроматографии высокого давления. Результаты исследований показывают, что предлагаемый штамм в течение 2 месяцев при температуре 20°С осуществляет деградацию 65,6% ТНТ.

Таблица 4 
Биодеградация ТНТ в почве при температуре 20°С штаммом Pseudomonas alcaligenes BS300 в течение 2 месяцев, % (М±m) 
Вещество Биодеградация, % 
ТНТ 72,2±6,4 
Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95% 


Пример 6. В эксикаторы объемом 3 дм 3 с 2 кг почвы, загрязненной ТНТ (100 мг/кг) вносят 15 мг/кг почвы солей Pb, Zn, Fe, Со и Cr - 50 мкг/кг и клетки штамма Pseudomonas putida BS300 до концентрации 1,0·10 7 КОЕ/г почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60% от общей влагоемкости и экспонируют при 20°С в течение 2 месяцев. Для анализа образцы почвы отбирают в начале эксперимента и через 2 месяца. Эффективность биодеградации нефти предлагаемым штаммом в почве оценивают методом жидкостной хроматографии высокого давления. Контролем служит почва, загрязненная ТНТ и внесенными микроорганизмами. Повторность опыта пятикратная. Результаты эксперимента показывают, что эффективность деградации ТНТ предлагаемым штаммом в вариантах с солями металлов и без них не отличается (таблица 5).

Таблица 5 
Биодеградация ТНТ в почве в присутствии тяжелых металлов штаммом Pseudomonas alcaligenes BS300, % (M±m) 
Вещество Биодеградация 
С металлами Без металлов 
ТНТ 88,7±7,2 84,5±5,9 
Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95% 


Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он при температуре 20°С утилизирует ТНТ в почве и воде. Предлагаемый штамм продуцирует биологические поверхностно-активные вещества, что ускоряет деградацию ТНТ в водной среде и почве. Устойчивость штамма к ионам тяжелых металлов расширяет диапазон его применения при очистке почвы и воды от комбинированного загрязнения ТНТ и металлами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Патент России №2001111823, 2003.05.10. Микробиологический способ удаления нитроароматического соединения, присутствующего в растворе или почве.

2. Jalal Hawari, Annamaria Halasz, Sylvie Beaudet, Louise Paquet, Guy Ampleman, and Sonia Thiboutot. Biotransformation of 2,4,6-Trinitrotoluene with Phanerochaete chrysosporium in Agitated Cultures at pH 4.5. Applied and Environmental Microbiology, 1999, Vol.65, No.7, p.2977-2986.

3. Jeong W. Pak, Kyle L. Knoke, Daniel R. Noguera, Brian G. Fox, and Glenn H. Chambliss. Transformation of 2,4,6-Trinitrotoluene by Purified Xenobiotic Reductase В from Pseudomonas fluorescens I-C. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66 (11):4742-4750.

4. Huang S., Lindahl P.A., Wang C., Bennett G.N., Rudolph F.B., Hughes J.B. 2,4,6-trinitrotoluene reduction by carbon monoxide dehydrogenase from Clostridium thermoaceticum. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66 (4):1474-1478.

5. Martin J.L., Comfort S.D., Shea P.J., Kokjohn Т.А., Drijber R.A. Denitration of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas savastanoi. Can J Microbiol, 1997, 43 (5):447-55.

6. Heiss, G., Hofmann, K. W., Trachtmann, N., Walters, D.M., Rouviere, P., Knackmuss, H.-J. (2002). Npd gene functions of Rhodococcus (opacus) erythropolis HL PM-1 in the initial steps of 2,4,6-trinitrophenol degradation. Microbiology, 148:799-806.

7. Boopathy R., Kulpa C., Wilson M. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by Desulfovibrio sp. (B strain). Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993, v.393, pp.270-275.

8. French C.E., Nicklin S., Bruce N.C. Aerobic Degradation of 2,4,6-Trinitrotoluene by En-terobacter cloacae PB2 and by Pentaerythritol Tetranitrate Reductase. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64 (8):2864-22868.

9. Pavlostathis S.G., Jackson G.H. Biotransformation of 2,4,6- trinitrotoluene in Anabena sp. Cultures. Environmental Toxicology and Chemistry, 1999, 18 (3):412-419.

10. Chul Hwan Park, Tak-Hyun Kim, Sangyong Kim, Seung-Wook Kim, Jinwon Lee, and Sun-Hwan Kim. Optimization for Biodegradation of 2,4,6-Trinitrotoluene (TNT) by Pseudomonas putida, Journal of Bioscience and Bioengineering, 2003.

11. Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition. Baltimore, Maryland: Williams&Wilkins, 1994. - 787 р.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes ВКПМ В-8810, используемый для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод от тринитротолуола in situ.




ПРОЧИТАТЬ НУЖНО ВСЕМ !
Судьба пионерских изобретений и научных разработок, которым нет и не будет аналогов на планете еще лет сорок, разве что у инопланетян



Независимый научно технический портал
Воздухо- и водоочистка. Опреснительные установки






СОВЕРШЕННО БЕСПЛАТНО!
Вам нужна ПОЛНАЯ ВЕРСИЯ данного патента? Сообщите об этом администрации портала. В сообщении обязательно укажите ссылку на данную страницу.


ПОИСК ИНФОРМАЦИИ В БАЗЕ ДАННЫХ


Режим поиска:"и" "или"

Инструкция. Ключевые слова в поле ввода разделяются пробелом или запятой. Регистр не имеет значения.

Режим поиска "и" означает, что будут найдены только те страницы, где встречается каждое из ключевых слов. Например, при запросе "очистка воды" будет найдено словосочетание "очистка воды". При использовании режима "или" результатом поиска будут все страницы, где встречается хотя бы одно ключевое слово ("очистка" или "воды").

В любом режиме знак "+" перед ключевым словом означает, что данное ключевое слово должно присутствовать в найденных файлах. Если вы хотите исключить какое-либо слово из поиска, поставьте перед ним знак "-". Например: "+очистка -воды".

Поиск выдает все данные, где встречается введенное Вами слово. Например, при запросе "сток" будут найдены слова "стоков", "стоки" и другие. Восклицательный знак после ключевого слова означает, что будут найдены только слова точно соответствующие запросу "сток!".


Устройства и способы водоочистки | Опреснительные установки. Дистилляторы | Устройства и способы воздухоочистки


Рейтинг@Mail.ru