ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas alcaligenes, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ГРУНТОВЫХ И ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД ОТ ТРИНИТРОТОЛУОЛА

ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas alcaligenes, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ГРУНТОВЫХ И ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД ОТ ТРИНИТРОТОЛУОЛА


RU (11) 2292392 (13) C2

(51) МПК
C12N 1/20 (2006.01)
C02F 3/34 (2006.01)
B09C 1/10 (2006.01)
C12R 1/40 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.12.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(21) Заявка: 2004137584/13 
(22) Дата подачи заявки: 2004.12.23 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.12.23 
(43) Дата публикации заявки: 2006.06.10 
(45) Опубликовано: 2007.01.27 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: RU 2001111823 С2, 10.05.2003. RU 2037523 C1, 19.06.1995. RU 2228953 С2, 20.05.2004. EP 1132462, 12.09.2001. US 5656169, 12.08.1997. 
(72) Автор(ы): Воробьев Алексей Владимирович (RU); Марченко Анатолий Иванович (RU); Руднева Ольга Александровна (RU); Дядищев Николай Романович (RU) 
(73) Патентообладатель(и): Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (НИЦ ТБП) (RU) 
Адрес для переписки: 142253, Московская обл., Серпуховский р-н, п/о Дашковка, ул. Ленина, 102А, НИЦ ТБП 

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas alcaligenes, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ГРУНТОВЫХ И ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД ОТ ТРИНИТРОТОЛУОЛА
Изобретение относится к микробиологии в частности для получения биопрепарата для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод при попадании в окружающую среду тринитротолуола. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes BS300 выделен из почвы, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, под номером В-8810. Данный штамм утилизирует тринитротолуол. Устойчивость штамма к ионам тяжелых металлов расширяет диапазон его применения при очистке почвы и воды от комбинированного загрязнения тринитротолуолом и металлами. Штамм Pseudomonas alcaligenes BS300 продуцирует биологические поверхностно-активные вещества, что ускоряет деградацию тринитротолуола в водной среде и почве. 5 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм, который может быть использован для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод при попадании в окружающую среду тринитротолуола (ТНТ).

2,4,6-тринитротолуол (ТНТ) производится нитрованием толуола в промышленных масштабах с конца 19 века во многих странах. Он используется в качестве взрывчатого вещества в военных и промышленных целях. ТНТ был обнаружен в сточных водах, поверхностных и почвенных водах, в почве и осадках вблизи предприятий его производящих. Загрязнение окружающей среды ТНТ представляет серьезную угрозу здоровью населения и природе. ТНТ мало растворим в воде, хорошо адсорбируется на минералах глины и гуминовых веществах почвы и очень медленно переходит в водную фазу, где его метаболизируют микроорганизмы.

Известны штаммы микроорганизмов: Penicillium sp. [1], Phanerochaete chrysosporium [2], Pseudomonas fluorescens I-C [3], Clostridium thermoaceticum [4], Pseudomonas savastanoi [5], Rhodococcus (opacus) erythropolis HL PM-I [6], Desulfovibrio sp. (B stram) [7], Enterobacter cloacae PB2 [8], Anabena sp. [9], Pseudomonas putida [10], которые могут разлагать ТНТ в почве и воде. Наиболее близким предлагаемому штамму является штамм бактерий Pseudomonas putida [10], обладающий высокими характеристиками по биодеградации ТНТ. Однако недостатком этого штамма является то, что для усиления биодеградации ТНТ необходимо добавлять поверхностно-активные вещества.

Задачей изобретения является получение нового штамма микроорганизмов, обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению к ТНТ, продуцирующего внеклеточные биологические поверхностно-активные вещества (биосурфактанты), который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных ТНТ и солями тяжелых металлов.

Предлагаемый штамм Pseudomonas alcaligenes BS300 выделен из почвы, загрязненной ТНТ, и селекционирован путем пересевов отдельных колоний бактерий на чашках с минимальным агаром А, который содержит (г/дм3) Na2HPO 4·Н2O - 6,0; КН 2PO4 - 3,0; NaCl - 0,5; NH 4Cl - 1,0; Mg2SO4 ·7H2O - 0,3; CaCl2 ·2H2O - 0,01; Агар-агар - 15,0; пируват натрия - 5 г, ТНТ - 100 мг. Вода дистиллированная - до 1 дм 3; рН - 7,2.

Штамм Pseudomonas alcaligenes BS300 идентифицирован в соответствии с определителем Берга [12] и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ В-8810.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфологическими и физиолого-биохимические признаками. Грамотрицательные подвижные палочки размером 2-3·0,6-0,8 мкм, спор не образует. На агаризованной питательной среде из кислотного гидролизата рыбной муки на вторые сутки образуются плоские, матовые колонии диаметром 2-3 мм. В бульоне из кислотного гидролизата рыбной муки растет в виде пленки и равномерного помутнения.

Штамм является аэробом, обладает оксидазной и каталазной активностью, растет в температурном диапазоне от 8 до 41°С, оптимум от 26 до 28°С. В качестве источника углерода потребляет ацетат, цитрат, сукцинат, аланин, аргинин. Обладает аргининдигидролазной активностью, восстанавливает нитраты, денитрификационная активность отсутствует. Прототроф, в дополнительных факторах роста не нуждается. Гидролизует желатин, обладает лецитиназной и уреазной активностью. Не гидролизует крахмал и поли- -оксибутират.

Штамм трансформирует ТНТ кометаболически в присутствии цитрата, сукцината.

Штамм не патогенен (не вирулентен, не токсичен, токсигенностью не обладает).

Проверка на патогенность проведена на белых мышах и белых крысах. На штамм оформлено заключение о безопасности.

Генетические особенности. Культура устойчива к антибиотикам ампициллину. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлов: Pb, Zn, Fe, Cr, Co - 50 мг/дм 3.

Штамм продуцирует биологические поверхностно-активные вещества (биосурфак-танты). Штамм хорошо растет на богатых питательных средах на основе мясопептонного бульона и ферментативного гидролизата рыбной муки, на синтетических питательных средах, где в качестве источника углерода используются сахароза, пируват, меласса.

Условия хранения: в лиофилизированном состоянии в ампулах при 4°С. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на агаризованной питательной среде, (г/дм 3): Na2HPO4 ·Н2О - 6,0; KH2 PO4 - 3,0; NaCl - 0,5; Mg 2SO4·7Н2 О - 0,3; CaCl2·2H2 O - 0,01; (NH4)2SO 4 - 0,25; агар-агар - 15,0; сахароза - 5 г; ТНТ - 50 мг; вода дистиллированная - до 1 дм3; рН - 7,2.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes BS300 выращивают на минеральной среде следующего состава, г/л: Na 2HPO4·Н2 O - 6,0; КН2PO4 - 3,0; NaCl - 0,5; Mg2SO4 ·7Н2О - 0,3; CaCl2 ·2H2O - 0,01; (NH4 )2SO4 - 0,25; агар-агар - 15,0; сахароза (или меласса) - 5; вода дистиллированная - до 1 дм3; рН - 7,2. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл питательной среды и 0,1% ксенобиотика (ТНТ) отдельно в каждую. Колбы засевают клетками предлагаемого штамма в концентрации 1,0·107 м.кл/см3 . В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, ТНТ и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в пяти повторностях. Колбы культивируют на качалке при 200 об./мин в течение 2,5 суток. Кометаболическую биодеградацию ТНТ определяют с использованием жидкостной хроматографии высокого давления. Данные эксперимента показывают, что предлагаемый штамм через 48 часов утилизирует 88% ТНТ, тогда как на среде без сахарозы или мелассы в качестве источника углерода биодеградации ТНТ не установлено.

Пример 2. В колбы на 100 см 3 вносят по 30 см3 синтетической среды (состав среды указан в примере 1), ТНТ из расчета 100 мг/л, 20 мг/л солей Pb, Zn, Fe, Cr, Co - 40 мг/дм3 , Hg - 86 мг/дм3 и клетки штамма Pseudomonas alcaligenes BS300 в концентрации 1,0·10 м.кл/см 3. Контролем служит засеянная колба с ТНТ. Исследуемые колбы культивируют в пяти повторностях на качалке при 28°С и 200 об./мин в течение 2 суток. Результаты эксперимента показывают, что эффективность деградации ТНТ предлагаемым штаммом в вариантах с солями металлов и без них не отличается (таблица 1).

Таблица 1 
Биодеградация ТНТ в присутствии тяжелых металлов штаммом Pseudomonas alcaligenes BS 300, % (M±m) 
Вещество Биодеградация 
С металлами Без металлов 
ТНТ 80,0±5,6 78,2±5,9 
Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95% 


Пример 3. Культуральную жидкость штамма Pseudomonas alcaligenes BS300, выращенного, как в примере 1, отделяют от микробных клеток центрифугированием при 5000 об./мин в течение 10 минут. В качестве биосурфактантсодержащей жидкости в опыте используют культуральная жидкость, разведенную дистиллированной водой в 10 раз. Поверхностное натяжение этой жидкости определяют с использованием кольцевого тензиометра. Контролем служит дистиллированная вода. Результаты определения поверхностного натяжения показывают (таблица 2), что добавление культуральной среды в дистилированную воду приводит к снижению поверхностного натяжения дистиллированной воды с 53,1 дин/см до 26,4 дин/см. Добавление незасеянной питательной среды в таком же соотношении 1:10 не оказывает влияния на поверхностное натяжение дистиллированной воды. Таким образом, культуральная жидкость предлагаемого штамма содержит биологические поверхностно-активные вещества.

Таблица 2 
Влияние биосурфактантобразующей культуральной жидкости штамма Pseudomonas aicaligenes BS300 на поверхностное натяжение дистиллированной воды, дин/см (М±m) 
Исследуемая жидкость Поверхностное натяжение 
Дистиллированная вода 56,1±4,2 
Биосурфактантсодержащая жидкость 28,4±3,3 
Дистилированная вода + питательная среда 53,1±2,6 
Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95% 


Пример 4. В колбы на 100 см3 вносят по 27 см 3 минеральной среды (состав среды указан в примере 1) и ТНТ из расчета 100 мг/л. В колбы добавляют по 3 см 3 биосурфактантсодержащей культуральной среды как в примере 3. Колбы засевают культурой Pseudomonas alcaligenes BS300 до концентрации 1,0·10 КОЕ/см3. В качестве контролей используют колбы с ТНТ. Культивирование проводят на качалке при 200 об./мин, температуре 20°С в течение 3 суток. Эффективность биодеградации ТНТ определяют методом жидкостной хроматографии высокого давления. Результаты экспериментов показывают (таблица 3), что добавление биосурфактанта повышает эффективность биодеградации ТНТ. Так, за 2 суток в вариантах опыта с добавлением биосурфактанта биодеградация ТНТ прошла на 100%.

Таблица 3 
Биодеградация тринитротолуола штаммом Pseudomonas alcaligenes BS300 при добавлении биосурфактанта, % (М±m) 
Вещество Биодеградация, % 
Биосурфактант добавлен Без биосурфактанта 
ТНТ 100% 62,2±5,8 
Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95% 


Пример 5. В эксикаторы объемом 3 дм3 вносят 2 кг дерново-подзолистой почвы, загрязненной 0,1% по массе ТНТ, и тщательно перемешивают.

Суспензию бактерий штамма Pseudomonas alcaligenes BS300 разводят фосфатным буферным раствором рН 7,2 и вносят в почву, загрязненную ксенобиотиком из расчета 1,0·10 7 КОЕ на 1 г почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60% от общей влагоемкости и экспонируют при 20°С в течение 2 месяцев. Для анализа образцы почвы отбирают в момент начала эксперимента и через 2 месяца. Эффективность биодеградации ТНТ предлагаемым штаммом в почве оценивают методом жидкостной хроматографии высокого давления. Результаты исследований показывают, что предлагаемый штамм в течение 2 месяцев при температуре 20°С осуществляет деградацию 65,6% ТНТ.

Таблица 4 
Биодеградация ТНТ в почве при температуре 20°С штаммом Pseudomonas alcaligenes BS300 в течение 2 месяцев, % (М±m) 
Вещество Биодеградация, % 
ТНТ 72,2±6,4 
Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95% 


Пример 6. В эксикаторы объемом 3 дм 3 с 2 кг почвы, загрязненной ТНТ (100 мг/кг) вносят 15 мг/кг почвы солей Pb, Zn, Fe, Со и Cr - 50 мкг/кг и клетки штамма Pseudomonas putida BS300 до концентрации 1,0·10 7 КОЕ/г почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60% от общей влагоемкости и экспонируют при 20°С в течение 2 месяцев. Для анализа образцы почвы отбирают в начале эксперимента и через 2 месяца. Эффективность биодеградации нефти предлагаемым штаммом в почве оценивают методом жидкостной хроматографии высокого давления. Контролем служит почва, загрязненная ТНТ и внесенными микроорганизмами. Повторность опыта пятикратная. Результаты эксперимента показывают, что эффективность деградации ТНТ предлагаемым штаммом в вариантах с солями металлов и без них не отличается (таблица 5).

Таблица 5 
Биодеградация ТНТ в почве в присутствии тяжелых металлов штаммом Pseudomonas alcaligenes BS300, % (M±m) 
Вещество Биодеградация 
С металлами Без металлов 
ТНТ 88,7±7,2 84,5±5,9 
Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95% 


Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он при температуре 20°С утилизирует ТНТ в почве и воде. Предлагаемый штамм продуцирует биологические поверхностно-активные вещества, что ускоряет деградацию ТНТ в водной среде и почве. Устойчивость штамма к ионам тяжелых металлов расширяет диапазон его применения при очистке почвы и воды от комбинированного загрязнения ТНТ и металлами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Патент России №2001111823, 2003.05.10. Микробиологический способ удаления нитроароматического соединения, присутствующего в растворе или почве.

2. Jalal Hawari, Annamaria Halasz, Sylvie Beaudet, Louise Paquet, Guy Ampleman, and Sonia Thiboutot. Biotransformation of 2,4,6-Trinitrotoluene with Phanerochaete chrysosporium in Agitated Cultures at pH 4.5. Applied and Environmental Microbiology, 1999, Vol.65, No.7, p.2977-2986.

3. Jeong W. Pak, Kyle L. Knoke, Daniel R. Noguera, Brian G. Fox, and Glenn H. Chambliss. Transformation of 2,4,6-Trinitrotoluene by Purified Xenobiotic Reductase В from Pseudomonas fluorescens I-C. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66 (11):4742-4750.

4. Huang S., Lindahl P.A., Wang C., Bennett G.N., Rudolph F.B., Hughes J.B. 2,4,6-trinitrotoluene reduction by carbon monoxide dehydrogenase from Clostridium thermoaceticum. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66 (4):1474-1478.

5. Martin J.L., Comfort S.D., Shea P.J., Kokjohn Т.А., Drijber R.A. Denitration of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas savastanoi. Can J Microbiol, 1997, 43 (5):447-55.

6. Heiss, G., Hofmann, K. W., Trachtmann, N., Walters, D.M., Rouviere, P., Knackmuss, H.-J. (2002). Npd gene functions of Rhodococcus (opacus) erythropolis HL PM-1 in the initial steps of 2,4,6-trinitrophenol degradation. Microbiology, 148:799-806.

7. Boopathy R., Kulpa C., Wilson M. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by Desulfovibrio sp. (B strain). Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993, v.393, pp.270-275.

8. French C.E., Nicklin S., Bruce N.C. Aerobic Degradation of 2,4,6-Trinitrotoluene by En-terobacter cloacae PB2 and by Pentaerythritol Tetranitrate Reductase. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64 (8):2864-22868.

9. Pavlostathis S.G., Jackson G.H. Biotransformation of 2,4,6- trinitrotoluene in Anabena sp. Cultures. Environmental Toxicology and Chemistry, 1999, 18 (3):412-419.

10. Chul Hwan Park, Tak-Hyun Kim, Sangyong Kim, Seung-Wook Kim, Jinwon Lee, and Sun-Hwan Kim. Optimization for Biodegradation of 2,4,6-Trinitrotoluene (TNT) by Pseudomonas putida, Journal of Bioscience and Bioengineering, 2003.

11. Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition. Baltimore, Maryland: Williams&Wilkins, 1994. - 787 р.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes ВКПМ В-8810, используемый для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод от тринитротолуола in situ.