ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES MEV, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ГРУНТОВЫХ И ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД ОТ НЕФТИ И ПРОДУКТОВ ЕЕ ПЕРЕРАБОТКИ

ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES MEV, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ГРУНТОВЫХ И ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД ОТ НЕФТИ И ПРОДУКТОВ ЕЕ ПЕРЕРАБОТКИ


RU (11) 2228953 (13) C2

(51) 7 C12N1/20, C02F3/34, B09C1/10, C12N1/20, C12R1:38 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.12.2007 - может прекратить свое действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(21) Заявка: 2002122613/13 
(22) Дата подачи заявки: 2002.08.23 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.08.23 
(45) Опубликовано: 2004.05.20 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: RU 2134723 С1, 20.08.1999. RU 2133770 С1, 27.07.1999. ЕР 1132462 А, 12.09.2001. US 5656169 А, 12.08.1997. WO 0056668 А1, 28.09.2000. 
(72) Автор(ы): Марченко А.И. (RU); Воробьев А.В. (RU); Дядищев Н.Р. (RU); Рыбалкин С.П. (RU); Блохин В.А. (RU); Марченко С.А. (RU) 
(73) Патентообладатель(и): Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (RU) 
Адрес для переписки: 142253, Московская обл., Серпуховский р-н, п/о Дашковка, ул. Ленина, 102А, НИЦ ТБП 

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES MEV, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ГРУНТОВЫХ И ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД ОТ НЕФТИ И ПРОДУКТОВ ЕЕ ПЕРЕРАБОТКИ 

Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes MEV выделен из ризосферы пшеницы, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, г.Москва под номером В-8278. Штамм утилизирует нефть, мазут, дизельное топливо; полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), содержащие от 2 до 4 бензольных колец: нафталин, фенантрен, антрацен, флуорантен; фенол. Он устойчив к ионам тяжелых металлов: Pb, Zn, Mo, Fe, Cr. Культура Pseudomonas alcaligenes MEV продуцирует биологические поверхностно-активные вещества (биосурфактанты). Штамм может быть использован для получения препарата для очистки почв, грунтовых и поверхностных вод от нефти, продуктов ее переработки, а также при комбинированном загрязнении углеводородами нефти и металлами. 10 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм, который может быть использован для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод от нефти и продуктов ее переработки.

Загрязнение окружающей среды нефтью и продуктами ее переработки представляет серьезную угрозу здоровью населения и природе. Тяжелые фракции нефти, токсичные и наиболее трудно разлагаемые, содержат полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). ПАУ относятся к категории приоритетных загрязнителей окружающей среды.

Известны штаммы микроорганизмов: Pseudomonas alcaligenes E7 [1], Trichoderma lignorum Л-1 ГКМ ВИЗР N 103 [2], Pseudomonas alcaligenes B-1 [3], Mycobacterium flavescens EX-91 [4], Rhodococcus species 56Д [5], Pseudomonas putida 9 [6], Rhodococcus species MFN [7], которые могут разлагать углеводороды нефти, в том числе и ПАУ в почве и воде. Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию полициклических ароматических углеводородов, содержащих только 2 и 3 бензольных кольца.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes E7 [1], обладающий высокими характеристиками по биодеградации нефти и нефтепродуктов. Однако недостатком этого штамма является то, что из полициклических ароматических углеводородов он утилизирует только нафталин при температуре 20-30С.

Цель изобретения состоит в получении нового штамма микроорганизмов, быстро и эффективно утилизирующего in situ в почвах, грунтовых и поверхностных водах нефть и продукты ее переработки при комбинированном загрязнении солями тяжелых металлов, а также продуцирующего внеклеточные биологические поверхностно активные вещества (биосурфактанты), которые ускоряют биодеградацию малорастворимых гидрофобных ПАУ.

Предлагаемый штамм Pseudomonas alcaligenes MEV выделен из ризосферы пшеницы и селекционирован путем пересевов отдельных колоний бактерий на чашках с минимальным агаром А [8], который содержит (г/дм2: Na2HPO4 H2O - 6,0; КН2РO4 - 3,0; NaCl - 0,5; NH4Cl - 1,0; Mg2SO4 7Н2О - 0,3; CaCl2 2H2O - 0,01; агар-агар - 15,0; вода дистиллированная - до 1 дм3; рН - 7,2; в присутствии фенантрена в количестве 300 мг на 1 дм3 питательной среды.

Штамм Pseudomonas alcaligenes MEV идентифицирован в соответствии с определителем Берга [9] и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ В-8278.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфологическими и физиолого-биохимическими признаками. Грамотрицательные подвижные палочки размером 2-3 0,6-0,8 мкм, спор не образует. На агаризованной питательной среде из кислотного гидролизата рыбной муки на вторые сутки образуются плоские матовые колонии диаметром 2-3 мм. В бульоне из кислотного гидролизата рыбной муки растет в виде пленки и равномерного помутнения.

Штамм является аэробом, обладает оксидазной и каталазной активностью, растет в температурном диапазоне от 8 до 41С, оптимум 26С. В качестве источника углерода потребляет ацетат, цитрат, сукцинат, аланин, аргинин. Обладает аргининдигидролазной активностью, восстанавливает нитраты, денитрификационная активность отсутствует. Прототроф, в дополнительных факторах роста не нуждается. Гидролизует желатин, обладает лецитиназной и уреазной активностью. Не гидролизует крахмал и поли--оксибутират.

Штамм непатогенен (невирулентен, нетоксичен, токсигенностью не обладает). На штамм оформлено заключение о безопасности.

Генетические особенности. Культура устойчива к пенициллину 50 мкг/см3, канамицину – 50 мкг/см3. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлов: Pb, Zn, Mo, Fe - 120 мг/дм3, Сr - 600 мкг/ дм3.

Культура использует в качестве единственного источника углерода нефть, нефтепродукты, полициклические ароматические углеводороды, содержащие 2, 3 и 4 бензольных кольца (нафталин, фенантрен, антрацен, флуорантен), а также фенол (таблица 3).

Штамм продуцирует биологические поверхностно-активные вещества (биосурфактанты). Штамм хорошо растет на богатых питательных средах на основе мясопептонного бульона (МПБ) и ферментативного гидролизата рыбной муки (ФГРМ).

Условия хранения: в лиофилизированном состоянии при 4С - 3 года; на агаризованном ферментативном гидролизате рыбной муки при 4С две недели, в пробирках на скошенном агаре под стерильным вазелиновым маслом при 4 - до года. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на агаризованном ферментативном гидролизате рыбной муки с 300 мг/дм3 фенантрена.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes MEV выращивают аэробно в жидкой среде на ферментативном гидролизате рыбной муки с 200 мг/л фенантрена на качалке при 200 об/мин и температуре 26±2С в течение 18 часов. Титр выросшей культуры составляет 2,0 109 колонии образующих единиц (КОЕ) на 1 см питательной среды.

Пример 2. Штамм Pseudomonas alcaligenes MEV выращивают на синтетической среде следующего состава, г/дм3: (NH4)2HPO4 - 0,5; КН2РO4 - 0,7; NaCl - 0,5; MgSO4·7H2O - 0,8; дистиллированная вода - до 1 дм3; рН 7,2. Нефть, мазут, дизельное топливо добавляют в питательную среду в количестве 1% от массы питательной среды в качестве единственного источника углерода. Опыт проводят в четырех повторностях. В колбы объемом 100 см3 вносят по 30 см3 минеральной среды и по 300 мг нефти, мазута и дизельного топлива. Колбы засевают клетками штамма Pseudomonas alcaligenes MEV до концентрации 1107 КОЕ/см3. В качестве контролей используют незасеянные колбы со средой, а также с нефтью и нефтепродуктами. Колбы культивируют на качалке при 200 об/мин и 30С течение 14 суток. Эффективность биодеградации определяют на газо-жидкостном хроматографе. Результаты эксперимента представлены в таблице 1. Полученные результаты показывают, что в течение 5 суток при 30С штамм MEV утилизирует нефть, мазут и дизельное на %: 72,0, 53,4, 94,3 соответственно.



Пример 3. Предлагаемый штамм культивируют также как в примере 2. Однако культивирование проводят при 20С. Результаты представлены в таблице 2.



Пример 4. В колбы на 100 см3 вносят по 30 см3 минеральной среды (состав среды указан в примере 2) и по 200 мг нафталина, фенантрена, антрацена, флуорантена, фенола. Колбы засевают культурой Pseudomonas alcaligenes MEV до концентрации 1107 КОЕ/см3. В качестве контролей используют незасеянные колбы со средой, а также с изучаемыми веществами. Культивирование проводят на качалке при 200 об/мин, температуре 20С в течение 5 суток. Эффективность биодеградации определяют на газо-жидкостном хроматографе. Результаты экспериментов показывают, что за 5 дней биодеградация нафталина и фенантрена прошла на 100%, а антрацена, флуорантена и фенола на %: 42,4; 62,1 и 46,3 соответственно (таблица 3).



Пример 5. В колбы на 100 см3 вносят по 30 см3 синтетической среды (состав среды указан в примере 2), 300 мг нефти, 15 мг/дм3 солей Pb, Zn, Mo, Fe и Cr 50 мкг/дм3 и клетки штамма Pseudomonas alcaligenes MEV до концентрации 1107 КОЕ/см3. Контролем служит засеянная колба с нефтью. Исследуемые колбы культивируют в четырех повторностях на качалке при 28С и 200 об/мин в течение 5 дней. Результаты эксперимента показывают, что эффективность деградации нефти предлагаемым штаммом в вариантах с солями металлов и без них не отличается (таблица 4).



Пример 6. Культуральную жидкость штамма Pseudomonas alcaligenes MEV, выращенного как в примере 1, отделяют от микробных клеток центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут. В качестве биосурфактантсодержащей жидкости в опыте используется культуральная жидкость разведенная дистиллированной водой в 10 раз. Поверхностное натяжение этой жидкости определяют с использованием кольцевого тензио-метра. Контролем служит дистиллированная вода. Результаты определения поверхностного натяжения показывают (таблица 5), что добавление культуральной среды в дистилированную воду приводит к снижению поверхностного натяжения дистиллированной воды с 68,8 дин/см до 31,2 дин/см. Добавление питательной среды в таком же соотношении 1:10 не оказывет влияния на поверхностное натяжение дистиллированной воды. Таким образом, культуральная жидкость предлагаемого штамма содержит биологические поверхностно-активные вещества.



Пример 7. В колбы на 100 см3 вносят по 27 см3 синтетической среды среды и смесь, содержащую по 200 мг нафталина, фенантрена, антрацена, флуорантена. В колбы добавляют по 3 см3 биосурфактантсодержащей кулыуральной среды как в примере 6. Колбы засевают культурой Pseudomonas alcaligenes MEV до концентрации 1107 КОЕ/см. В качестве контролей используют колбы со смесью нафталина, фенантрена, антрацена и флуорантена. Культивирование проводят на качалке при 200 об/мин, температуре 20С в течение 5 суток. Эффективность биодеградации полициклических ароматических углеводородов определяют на газожидкостном хроматографе. Результаты экспериментов показывают (таблица 6), что добавление биосурфактанта повышает эффективность биодеградации ПАУ. Так, за 5 суток в вариантах опыта с добавлением биосурфактанта биодеградация нафталина и фенантрена прошла на 100%, а антрацена и флуорантена на %: 71%, 83% соответственно.



Пример 8. В эксикаторы объемом 3 дм3 с 2 кг дерново-подзолистой почвы вносят 1% по массе нефти, мазута, дизельного топлива и тщательно перемешивают.

Суспензию бактерий штамма Pseudomonas alcaligenes MEV разводят фосфатньм буферньм раствором рН 7,2 и вносят в почву, загрязненную ксенобиотиками из расчета 1107 КОЕ на 1 г почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60% от общей влагоемкости и экспонируют при 20С в течение 2 месяцев. Для анализа образцы почвы отбирают в момент начала эксперимента и через 2 месяца. Эффективность биодеградации нефти и продуктов ее переработки предлагаемым штаммом в почве оценивают методом газожидкостной хроматографии. Результаты исследований показывают, что предлагаемый штамм в течение 2 месяцев при температуре 20С осуществляет деградацию 74% нефти, 63% мазута и 100% дизельного топлива.



Пример 9. Предлагаемый штамм вносят в почву так же как в примере 8. Однако эксперимент проводят при 30С. Результаты представлены в таблице 8.



Пример 10. В эксикаторы объемом 3 дм с 2 кг дерново-подзолистой почвы вносят 1% по массе смеси нафталина (4 г), фенантрена (4 г), антрацена (4 г), флуорантена (4 г), фенола (4 г) и тщательно перемешивают. Суспензию бактерий штамма Pseudomonas alcaligenes MEV полученную как в примере 1 разводят фосфатным буферным раствором с рН 7,2 до титра 1108 КОЕ/см3 и вносят в почву, загрязненную ксенобиотиками из расчета 1107 КОЕ на 1 г почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60% от общей влагоемкости и экспонируют при 20С в течение 2 месяцев. Для анализа образцы почвы отбирают в начале эксперимента и через 2 месяца. Эффективность биодеградации нефти и продуктов ее переработки предлагаемым штаммом в почве оценивают методом газожидкостной хроматографии. Результаты исследований показывают, что предлагаемый штамм в течение 2 месяцев при температуре 20С осуществляет деградацию 100% нафталина и фенантрена, 86% флуорантена, 46% антрацена и 63% фенола.



Пример 11. В эксикаторы объемом 3 дм3 с 2 кг дерново-подзолистой почвы вносят 20 г нефти и 15 мг/кг почвы солей Pb, Zn, Mo, Fe, и Сr - 50 мкг/кг и клетки штамма Pseudomonas alcaligenes MEV до концентрации 1107 КОЕ/г почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60% от общей влагоемкости и экспонируют при 20С в течение 2 месяцев. Для анализа образцы почвы отбирают в начале эксперимента и через 2 месяца. Эффективность биодеградации нефти предлагаемым штаммом в почве оценивают методом газожидкостной хроматографии. Контролем служит почва с нефтью и внесенными микроорганизмами. Повторность опыта четырехкратная. Результаты эксперимента показывают, что эффективность деградации нефти предлагаемым штаммом в вариантах с солями металлов и без них не отличается (таблица 10).



Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он утилизирует при температуре 20 - 30С нефть, мазут и дизельное топливо в почве и воде от 43,4% до 97,3%, а также полициклические ароматические углеводороды, содержащие от 2 до 4 бензольных колец (нафталин, фенантрен, антрацен, флуорантен). Предлагаемый штамм продуцирует биологические поверхностно-активные вещества, что ускоряет деградацию полициклических ароматических углеводородов в водной среде. Устойчивость штамма к ионам тяжелых металлов расширяет диапазон его применения при очистке территорий от комбинированного загрязнения углеводородами нефти и металлами.

Список литературы

1. Патент России №2134723, кл. C 12 N 1/20. Штамм Pseudomonas alcaligenes E7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1999.

2. Патент России №2157842, кл. C 12 N 1/26. Штамм Trichoderma lignorum Л-1 ГКМ ВИЗР №103 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов. - 2000.

3. Патент России №2133770, кл. C 12 N 1/20. Штамм Pseudomonas alcaligenes B-1, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1999.

4. Патент России №92005971, кл. C 12 N 1/20. Штамм Mycobacterium flavescens EX-91, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1996.

5. Патент России №95119734, кл. C 12 N 1/20. Штамм Rhodococcus species 56D, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1998.

6. Патент России №2134722, кл. C 12 N 1/20. Штамм Pseudomonas putida 9, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1999.

7. Патент России №2133769, кл. C 12 N 1/20. Штамм Rhodococcus species MFN, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1998.

8. Дэвис Р., Бодстайн Д., Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий. Пер. с англ. под редакцией чл. - корр. АН СССР Р.Б.Хесина. - М: Мир, 1984-176 с.

9. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition. Baltimore, Maryland: Williams&Wilkins, 1994. – 787 р. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Сурфактантобразующий штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes MEV депонирован в ВКПМ В-8278, используемый для очистки почв, грунтовых и поверхностных вод от нефти и продуктов ее переработки in situ.




ПРОЧИТАТЬ НУЖНО ВСЕМ !
Судьба пионерских изобретений и научных разработок, которым нет и не будет аналогов на планете еще лет сорок, разве что у инопланетян



Независимый научно технический портал
Воздухо- и водоочистка. Опреснительные установки






СОВЕРШЕННО БЕСПЛАТНО!
Вам нужна ПОЛНАЯ ВЕРСИЯ данного патента? Сообщите об этом администрации портала. В сообщении обязательно укажите ссылку на данную страницу.


ПОИСК ИНФОРМАЦИИ В БАЗЕ ДАННЫХ


Режим поиска:"и" "или"

Инструкция. Ключевые слова в поле ввода разделяются пробелом или запятой. Регистр не имеет значения.

Режим поиска "и" означает, что будут найдены только те страницы, где встречается каждое из ключевых слов. Например, при запросе "очистка воды" будет найдено словосочетание "очистка воды". При использовании режима "или" результатом поиска будут все страницы, где встречается хотя бы одно ключевое слово ("очистка" или "воды").

В любом режиме знак "+" перед ключевым словом означает, что данное ключевое слово должно присутствовать в найденных файлах. Если вы хотите исключить какое-либо слово из поиска, поставьте перед ним знак "-". Например: "+очистка -воды".

Поиск выдает все данные, где встречается введенное Вами слово. Например, при запросе "сток" будут найдены слова "стоков", "стоки" и другие. Восклицательный знак после ключевого слова означает, что будут найдены только слова точно соответствующие запросу "сток!".


Устройства и способы водоочистки | Опреснительные установки. Дистилляторы | Устройства и способы воздухоочистки


Рейтинг@Mail.ru