ШТАММ МИКРОМИЦЕТА FUSARIUM SP. N 56 ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

ШТАММ МИКРОМИЦЕТА FUSARIUM SP. N 56 ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ


RU (11) 2126041 (13) C1

(51) 6 C12N1/14, C02F3/34, B09C1/10, C12N1/14, C12R1:77 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.12.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(21) Заявка: 97122047/13 
(22) Дата подачи заявки: 1997.12.15 
(45) Опубликовано: 1999.02.10 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: RU 1805097 C1, 30.03.93. US 4415661 C, 15.11.83. 
(71) Заявитель(и): Уфимский государственный нефтяной технический университет 
(72) Автор(ы): Ягафарова Г.Г.; Гатауллина Э.М.; Барахнина В.Б.; Ягафаров И.Р.; Сафаров А.Х. 
(73) Патентообладатель(и): Уфимский государственный нефтяной технический университет 
Адрес для переписки: 450062 Башкортостан Уфа, ул.Космонавтов 1, УГНТУ пат.отдел 

(54) ШТАММ МИКРОМИЦЕТА FUSARIUM SP. N 56 ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ 

Изобретение относится к нефтегазодобывающей и нефтеперерабатывающей промышленностям и может быть использовано при аварийных разливах нефти и утилизации нефтепродуктов. Предлагается новый штамм микромицета Fusarium sp. N 56, характеризующийся высокой скоростью утилизации нефти и степенью биотрансформации тяжелых фракций нефти и органических добавок в буровой раствор. Технический результат изобретения-повышение эффективности очистки от нефтезагрязнений. 6 табл. 1 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма микромицета, используемого для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

Известны штаммы микроорганизмов, способные разрушать нефть и нефтепродукты в слабоминерализованных водах, однако применение этих штаммов с целью очистки высокоминерализованных нефтесодержащих сточных вод и буровых отходов, содержащих полимерные добавки, неизвестно.

Известен штамм актиномицета Actinomyces flavus, обладающий способностью усваивать углеводороды нефти. Однако данный штамм не способен разрушать нефть, нефтепродукты и буровые отходы в высокоминерализованных нефтесодержащих сточных водах и почве.

Известен штамм Streptormyces alboaxialis "с", используемый для очистки сточных вод от нефти и нефтепродуктов в сточных водах, содержащих до 10% NaCl. Недостатком известного штамма является низкая эффективность очистки высокоминерализованной воды от нефти и нефтепродуктов, кроме того, штамм не способен очищать буровые отходы от нефти, нефтепродуктов в присутствии полимерных добавок, например омыленных синтетических жирных кислот и др.

Известны микроорганизмы, окисляющие различные нефтепродукты, например н-алканы C10-C40 (авторское свидетельство СССР N 525751, кл. C 12 N 3/00), дизельное топливо (авторское свидетельство СССР N 77226, кл. C 12 N 11/08), сырую нефть (авторское свидетельство CCCP N 803482, кл. C 12 N 11/08).

Известен способ разложения нефти и нефтепродуктов с использованием микромицетов рода Actinomucor elegans штамм NTC-405 АТСС 20613; Jeotrichum marlum, Thirumalachar sp. nov. ATCC 20614 патенты США N 4415662, кл. C 12 N 11/14, C 12 N 1/26, C 10 O 32/00; N 4415661, кл. C 12 N 11/00, C 12 N 11/26, C 12 N 1/14, C 10 N 32/10).

Недостатком этих способов является низкая скорость роста предлагаемых микромицетов, более сложные и дорогостоящие добавки-биостимуляторы в питательный раствор и более длительный период адаптации к нефтепродуктам, а также низкая скорость роста и степень биотрансформации тяжелых фракций нефти, ароматических углеводородов (фенола) и др. Наиболее близким аналогом является штамм Rhodococcus erythropolis ВКМ АС 1339Д (патент РФ N 1805097 C 02 F 3/34, E 02 B 15/04). Недостатком известного штамма является низкая скорость утилизации нефти и неполная степень биотрансформации фракций нефти и токсичных органических добавок: омыленных синтетических жирных кислот и др. в высокоминерализованных средах.

Целью изобретения является получение нового штамма микромицета Fusarium sp. N 56, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и степенью биотрансформации тяжелых фракций нефти и органических добавок в буровой раствор.

Предлагаемый штамм Fusarium sp. депонирован в РАСХН, г. Санкт-Петербург и имеет регистрационный номер 56. Штамм микромицета получен путем селекции из природных образцов нефтесодержащих почв НГДУ "Туймазанефть" Республики Башкортостан. Для селекции 1 г почвы вносили в колбу объемом 250 мл, содержащую 99 мл стерильной водопроводной воды и после дальнейшего разведения до 105-106 степени делали посевы на среду Чапека, CA 3o Б. После 7 суток культивирования наиболее типичные колонии испытывали на способность расти на твердой минеральной среде Маккланга, г/л дистиллированной воды: NaNO3 - 2,0; MnSO47H2O - 0,5; K2HPO4 - 1,0; Fe2(SO4)3 - 0,001; ZnSO4 - 0,002; агар - 15, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии гексадекан. Для этого в чашки Петри разливали стерильную питательную минеральную среду. После того как среда застынет, стерильным пробочным сверлом делали лунку. В лунку вносили стерилизованный заранее гексадекан. Посев микроорганизмов производили штрихом. О росте судили после 15 суток культивирования по появлению колоний на штрихе. Наиболее активный штамм идентифицировали. Штамм хранится в лиофилизированном виде.

Штамм имеет следующую характеристику: oбразует хорошо развитый мицелий на сусле 3oБ, а также среде Чапека следующего состава, г/л дистиллированной воды: NaNO3 - 2; глюкоза - 20; K2HPO4 - 1,0; MnSO47H2O - 0,5; KCl-0,5; FeSO47H2O - 0,01.

Вегетативный мицелий не окрашен, молодые колонии белые или сероватые. По мере развития колонии приобретают серую окраску. Пигмент диффундирует в среду. Воздушный мицелий хрупкий, слегка пушистый, вначале сероватый, затем темно-серый. Конидиеносцы легко отделяются от гиф, легко ломаются, одиночные или ветвистые, бесцветные или слабо пигментированные, септированные; различной длины, прямые или изогнутые, светлые, гладкие, ветвистые.

Питательную ценность углеводов учитывали по массе образующегося с ним мицелия. Исследования показали, что особенно хорошо из числа cахаров усваивается глюкоза, хуже фруктоза, галактоза, L-арабиноза. Из дисахаридов лучше усваивается сахароза, чем лактоза.

Глюкозу окисляют в тесте Хью-Лайфсона. Не содержат арилсульфатазы, не разлагают целлюлозу, ксантин, эластин. Как правило, не разлагают гипоксантин, казеин, желатину, не гидролизуют крахмал.

Слабо используют муравьиную кислоту HCOOH. Щавелевая кислота COOH-COOH практически не потребляется и обладает токсичностью.

Хорошо усваивают жиры, предварительно расщепляя их на жирную кислоту и глицерин липазами. Из продуктов расщепления жиров Fusarium sp. N 56 раньше всего потребляет глицерин, а потом уже жирные кислоты: пальмитиновую, стеариновую, олеиновую.

На смесях углеводов рост Fusarium sp. N 56 заметно усиливается.

Хорошо усваивают маннит, глюконовую, сахарную кислоты.

Хорошо растут на среде с парафиновыми углеводородами: проявляют активный рост на индивидуальных н-алканах C13-C37.

Не обладают лецитиназной активностью, что указывает на то, что патогенные свойства у культур не должны проявляться.

Хорошо усваивают кислоты, особенно валериановую, хуже масляную и пропионовую.

Культура является одним из штаммов Fusarium, у которого обнаружены следующие свойства: использует галактозу, арабинозу, глицерин, инозит, лактозу, мальтозу, маннит, рамнозу, сорбит, сахарозу, глюкозу, лимоннокислый натрий, мочевину; не проявляет тирозиназную активность, нитрат-редуктазную активность, не растет в присутствии 7%-ного хлористого натрия. Не использует лактат натрия, ксилозу.

Аэробы, растут в диапазоне температур от 10 до 40oC, оптимальная область от 25 до 30oC. Растет в диапазоне pH = 4-8, оптимальная зона от 7 до 8. Штамм не патогенен для человека и животных.

Биотехнологическая характеристика штамма Fusarium sp. N 56.

Изучена активность штамма при его выращивании на среде с добавлением в качестве единственного источника углерода и энергии сырой нефти Туймазинского месторождения и ее фракций и наиболее широко используемых добавок в буровой раствор: ОСЖК, КМЦ.

Для получения посевного материала используют среду Маккланга с гексадеканом.

Исследования проводились по следующей методике.

Пример 1. Минеральную среду Маккланга разливали по 100 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизовали при 1 атм. в течение 30 мин. Предварительно простерилизованную нефть вносили в количестве 1 мас.%, засевали 3 об.% бактериальной взвеси. Выращивание осуществляли на термостатированной качалке при 180 об/мин и температуре 30oC. Опыты ставились в трех повторностях. Контролем служили: минеральная среда с культурой без нефти, минеральная среда и нефть без бактерий. По истечении 36 ч в опытных колбах наблюдается значительное уменьшение количества нефти. О биотрансформации нефти судили спектрофотометрически на спектрофотометре UR-20 при 2923 см-1, предварительно экстрагируя нефть четыреххлористым углеродом. Кроме того, ежесуточно определяли количество жизнеспособных клеток методом Коха (Теппер В.3., Шильникова Г. И. Практикум по микробиологии.-М.: Колос, 1979, 211 с.), а также биомассу весовым методом на мембранных фильтрах. Для этого мембранные фильтры N 1 предварительно доводили до постоянного веса. Результаты приведены в табл. 1 и 2.

Как видно из табл. 1, скорость роста микромицетов выше скорости роста с Rhodococcus erithropolis AC 1339Д и составляет через 36 ч 5108 кл/мл (нач. 1-106 кл/мл), а прирост биомассы за это же время превышает 0,65 г/л. Степень биоразложения нефти за 36 ч в среде с Fusarium sp. N 56 на 20% выше, чем в среде с Rhodococcus erithropolis AC 1339Д (табл. 2).

Пример 2. В серии опытов штамм микромицетов выращивали в минеральной среде Чапека с добавлением в качестве единственного источника углерода и энергии гексадекана, дизельного топлива, сырой нефти, мазута, КМЦ в количестве 1 мас.%; ОСЖК - 0,1 мас.%. Условия засева и выращивания описаны выше. Культивирование проводили в течение 48 ч. О биодеградации дизельного топлива, нефти, мазута судили путем количественного анализа методом экстракции этих соединений четыреххлористым углеродом с помощью измерения оптической плотности экстракта при 2923 см-1 на спектрофотометре UR-20, а гексадекана при 1460 см-1.

О биодеградации ОСЖК судили по его остаточному количеству, которое определяли известным весовым методом после экстракции четыреххлористым углеродом.

В результате исследований выявлено, что предлагаемый штамм Fusarium sp. N 56 способен биотрансформировать не только легкие фракции нефти, гексадекан и дизельное топливо, но и тяжелую фракцию нефти - мазут, а также буровые реагенты (ОСЖК и КМЦ). После 48 ч культивирования микромицетов степень очистки достигает для гексадекана в среднем 90%, дизельного топлива - 50%, нефти - 87%, мазута - 49%, ОСЖК - 80% (см. чертеж).

О степени биодеградации КМЦ судили косвенно по приросту общей биомассы микроорганизмов, изменению содержания редуцирующих cахаров в культуральной жидкости, динамике активности дегидрогеназы в культуральной жидкости и изменению pH среды. Для сравнения использовался известный штамм Rhodococcus erythropolis 1339 Д и ассоциация микроорганизмов Rhodococcus erythropolis 1339 Д+Fusarium sp. N 56. Результаты исследований представлены в табл.3.

Установлено, что вышеназванные микроорганизмы способны интенсивно деградировать КМЦ. Свидетельством этому служит активный прирост общей микробной биомассы. Tак, через 10 суток в среде с монокультурами биомасса увеличилась в среднем в 1,6 раза, а в среде с ассоциацией - в 2,5 раза.

Через пять суток культивирования наблюдался значительный прирост количества редуцирующих cахаров, причем максимальное количество их образуется в среде с ассоциацией микроорганизмов. Далее наблюдается закономерное уменьшение количества редуцирующих сахаров, которое объясняется тем, что они как промежуточные продукты ферментативного гидролиза КМЦ вовлекаются в дальнейший каскад биохимических превращений вплоть до образования микробиологического белка.

О биодеградации КМЦ свидетельствует и высокий уровень активности дегидрогеназы в культуральной жидкости. Самое высокое значение обнаружено в опыте с ассоциацией микроорганизмов: Rhodococcus erythropolis 1339 Д + Fusarium sp. N 56 - 0,53 мг формазана.

Пример 3. Изучали влияние содержания NaCl 1,3,5% на биотрансформацию нефти и ОСЖК. Начальное количество нефти составляло 1 мас.%, ОСЖК - 0,01 мас. %. Культивирование проводили в течение трех суток. Инокуляцию микромицета и культивирование микромицета проводили по вышеописанной методике на минеральной среде (табл. 4).

Как видно из табл.4, микромицеты способны активно биотрансформировать нефть и ОСЖК в среде с NaCl до 5%. При этом степень окисления нефти (1 мас. %) после трех суток культивирования составляет 40%; ОСЖК 0,1 и 0,05 мас.% - 30 и 20% соответственно.

Пример 4. Проводили изучение активности штамма Fusarium sp. N 56 при разложении нефти и ОСЖК в почве. Для этого в фарфоровые чашки объемом 0,2 л помещали по 100 г чернозема. Влажность почвы доводили до 60% от полной влагоемкости. В первую серию чашек вносили нефть - 1 мас.%, во вторую ОКО - 0,5 мас. %. Посевной материал вносили из расчета 5% по объему. Контролем служили серии чашек без инокуляции. Плесневый гриб культивировали при комнатной температуре. Время культивирования - 40 суток. Количественный учет биоразложения нефти и ОСЖК вели известным весовым методом (Лурье Ю.Ю. Унифицированные методы анализа вод.-М.: Химия, 1973, 215 с.), предварительно экстрагировав загрязнители четыреххлористым углеродом. Результаты исследований приведены в табл. 5.

Таким образом, предлагаемый штамм Fusarium sp. N 56 остается активным и почве. Биоразложение нефти через сорок суток культивирования составляет 77,53%. В контроле естественная убыль нефти составляет 2,62%.

Пример 5. Очистка стоков Новоуфимского нефтеперерабатывающего завода.

Посевной материал выращивали в жидкой минеральной среде Чапека. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляли гексадекан в количестве 3% по объему. Для этого среду разливали по 50 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизовали при 1 атм. в течениe 30 мин. Гексадекан стерилизовали отдельно и вносили перед посевом. Микроорганизмы вносили путем смыва с косячков. Выращивание микромицета осуществляли на термостатированной качалке при 95 об/мин, и температуре 30oC. Посевной материал выращивали в течениe 3 суток. Два литра сточной воды, содержащей 0,05 мас.% ОСЖК, наливали в лабораторный аэротенк объемом 5 л. Вносили посевной материал в количестве 5% от объема. При помощи 5%-ного раствора NaHCO3 доводили pH до 7. В аэротенк при помощи компрессора продувался воздух в количестве 15-20 л в минуту. О биодеструкции ОСЖК судили по его остаточному количеству, которое определяли известным весовым методом после экстракции четыреххлористым углеродом, и фракционному составу ОСЖК и продуктов его биоразложения, который определяли на масс-спектрометре МИ 12-01Б (при давлении 10-7 мм рт. ст., температуре от 20 до 500oC). Косвенно о биоразложении ОСЖК в водной среде судили по приросту численности микроорганизмов и увеличению биомассы. Результаты исследований представлены в табл. 6.

Из табл. 6 видно, что предлагаемая культура Fusarium sp. N 56 способна очищать воду от ОСЖК (при этом через 14 суток культивирования процент биоразложения ОСЖК составил 85,143%) и может быть использована при бурении нефтяных и газовых скважин для биоочистки отработаного бурового раствора от ОСЖК. Предлагаемая культура Fusarium sp. N 56 может быть также использована для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов при аварийных разливах нефти в нефтедобывающей, нефтеперерабатывающей промышленности, при транспортировке нефти. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Штамм микромицета Fusarium sp. N 56 (депонирован во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. С. -Петербург) для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.




ПРОЧИТАТЬ НУЖНО ВСЕМ !
Судьба пионерских изобретений и научных разработок, которым нет и не будет аналогов на планете еще лет сорок, разве что у инопланетян



Независимый научно технический портал
Воздухо- и водоочистка. Опреснительные установки






СОВЕРШЕННО БЕСПЛАТНО!
Вам нужна ПОЛНАЯ ВЕРСИЯ данного патента? Сообщите об этом администрации портала. В сообщении обязательно укажите ссылку на данную страницу.


ПОИСК ИНФОРМАЦИИ В БАЗЕ ДАННЫХ


Режим поиска:"и" "или"

Инструкция. Ключевые слова в поле ввода разделяются пробелом или запятой. Регистр не имеет значения.

Режим поиска "и" означает, что будут найдены только те страницы, где встречается каждое из ключевых слов. Например, при запросе "очистка воды" будет найдено словосочетание "очистка воды". При использовании режима "или" результатом поиска будут все страницы, где встречается хотя бы одно ключевое слово ("очистка" или "воды").

В любом режиме знак "+" перед ключевым словом означает, что данное ключевое слово должно присутствовать в найденных файлах. Если вы хотите исключить какое-либо слово из поиска, поставьте перед ним знак "-". Например: "+очистка -воды".

Поиск выдает все данные, где встречается введенное Вами слово. Например, при запросе "сток" будут найдены слова "стоков", "стоки" и другие. Восклицательный знак после ключевого слова означает, что будут найдены только слова точно соответствующие запросу "сток!".


Устройства и способы водоочистки | Опреснительные установки. Дистилляторы | Устройства и способы воздухоочистки


Рейтинг@Mail.ru