КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER CALCOACETICUS, PSEUDOMONAS FLUORESCENS, ALCALIGENES FAECALIS ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER CALCOACETICUS, PSEUDOMONAS FLUORESCENS, ALCALIGENES FAECALIS ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ


RU (11) 2107722 (13) C1

(51) 6 C12N1/20, C02F3/34, C12N1/20, C12R1:27, C12R1:01 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.12.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(21) Заявка: 96117870/13 
(22) Дата подачи заявки: 1996.09.04 
(45) Опубликовано: 1998.03.27 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: RU, патент, 2023686, кл. C 02 F 3/34, 1994. SU, авторское свидетельство, 1493666, кл. C 12 N 1/20, 1989. RU, патент, 2038333, кл. C 02 F 3/34, 1995. 
(71) Заявитель(и): Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ 
(72) Автор(ы): Биттеева М.Б.; Бирюков В.В.; Щеблыкин И.Н.; Осипова В.Г.; Барбот В.С.; Шушеначева Е.В.; Коваленко Н.В.; Стехновская Л.Д.; Левандовская Ю.Б.; Цупрун К.М. 
(73) Патентообладатель(и): Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ 

(54) КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER CALCOACETICUS, PSEUDOMONAS FLUORESCENS, ALCALIGENES FAECALIS ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ 

Консорциум психрофильных бактерий: Acinetobacter calcoaceticus Baumann et al. штамм 279 ВКПМ -В-7179, Psеudomonas fluorescens Stanier et al. штамм 325 ВКПМ-В-7152, Alcaligenes faecalis Castellani et Chalmers штамм 404 ВКПМ-В-7180- предназначен для очистки почвы, воды, емкостей и сточных вод промышленных предприятий от загрязнений нефтепродуктами в северных регионах страны при 3 - 15oC. Селекционированные психрофильные штаммы бактерий характеризуются высокой окислительной способностью, устойчивостью в длительном непрерывном и периодическом процессе, растут активно в пресной и морской воде при соотношении культур, %: (35 : 40 : 25) - (30 : 50 : 20). 2 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями почвы, воды и емкостей нефтью и нефтепродуктами с помощью специально подобранной ассоциации психрофильных культур бактерий.

Процесс самоочищения в естественных условиях Севера, Западной Сибири, районах, где недолгий летний период времени, очень длителен, что связано с бедностью флоры нефтеокисляющих бактерий, дефицитом органики, аэрации, низкой температурой и pH очищаемой среды.

Известна ассоциация нефтеокисляющих культур Rhodococcus erythropolis 367-2, Rhodococcus maris 367-5, Rhodococcus erythropolis 367-6, Pseudomonas stutzeri 367-1, Candida lipolytica 367-3 [1] , входящих в биопрепарат "Деворойл".

Недостатком известной ассоциации является применение дорогостоящей углеводной среды для получения биомассы препарата и более высокая температура культивирования 20-40oC, при которой длительно адаптированная к нефти ассоциация способна развиваться, что ограничивает область применения в средней и южной полосе России.

Известна другая ассоциация нефтеокисляющих культур: Rhodococcus erythropolis ВКПМ-В-3078 (36а-1), Rhodococcus luteus ВКПМ-В-3079 (25) и Micrococcus flavus ВКПМ-В-3077 (53) [2]. Для данной ассоциации культур оптимальная температура 23-26oC, pH среды 6,0-8,5, оптимум - pH 7,0.

Недостатком известной ассоциации является низкая концентрация в среде окисляемого нефтепродукта 80-100 мг/л в аэротенке опытно-промышленной установки с коэффициентом разбавления 0,126-0,167 ч-1, более узкий интервал pH среды 6,0-8,5 при обязательном наличии концентрации активного или 1,5 г ACB/л. Известно, что активный ил обеспечивает окисление многих веществ, поступающих на очистные сооружения, включая и нефтепродукты. Однако даже в этом случае не достигается требование санэпиднадзора к очищенной воде для рыбохозяйственного назначения (ПДК - 0,05 мг/л). Содержание остаточных нефтепродуктов после очистки равно 1,0-1,5 мг/л.

Наиболее близким по техническому решению к изобретению является ассоциация бактерий вида Acinetobacter oleovorum ЦМПМ-В-1878 и ВКПМ У-4091, развивающаяся при более широком диапазоне pH среды 4,5-8,5 и температуре 16-42oC, высокой скорости протока среды Д-0,33 ч-1 и концентрации нефтепродукта в среде 1 - 5 мас.%, при этом процент очистки достигается 93-95% [3].

Недостатком прототипа является относительно высокая температура культивирования 16oC и более.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности очистки при низкой температуре 3-15oC, что позволяет охватывать северные регионы страны, загрязненные нефтепродуктами при скорости биодеструкции 0,055 г углеводородов нефти/г биомассы x ч - 0,198 г углеводородов нефти/г биомассы x ч.

Для этого предлагается использовать консорциум бактерий: ВКПМ-В-7179 - Acinetobacter calcoaceticus - 279, ВКПМ-В-7152 - Pseudomonas fluorescens - 325, ВКПМ-В-7180 - Alcaligenes faecalis - 404, в водном растворе минеральных компонентов питания.

Психрофильные штаммы деструкторы нефти и нефтепродуктов выделены: Pseeudomonas fluorescens штамм 325 ВКПМ-В-7152 из почв, пропитанных мазутом, около котельной Кировского завода г. Санкт-Петербурга, Alcaligenes faecalis штамм 404 ВКПМ-В-7180 из активного ила очистных сооружений г. Сетуни, Acinetobacter calcoaceticus штамм 279 ВКПМ-В-7179 из воды, покрытой тонким слоем нефтепродуктов в разливах р. Волги близ г. Астрахани; каждый из штаммов получен методом накопительной культуры, в результате многократных пассажей на минеральной среде с нефтью - 1 г/л или мазутом - 500 мг/л, затем на более очищенном сырье - дизельном топливе фракции 240-360oC - 5 об.%.

Выращивание проводилось в колбах: объем - 100 мл минеральной среды, на качалке при 220 об/мин, pH - 7,0 и температуре культивирования 3-15oC.

Селекционированные штаммы имеют следующие морфологические, физиолого-биохимические свойства.

Acinetobacter calcoaceticus штамм 279 ВКПМ-В-7179 - грамотрицательные неподвижные, толстые, короткие палочки, встречаются кокковидные одиночные или сдвоенные, редко цепочки, часто клетки расположены под углом размером 0,7х1,4, 0,7х2,8, 1,0х1,1 мкм, размножаются делением: перетяжка и перегородка, каталазоположительные, оксидазоотрицательные, индол, сероводород не образуют; желатину не разжижает; молоко не изменяет, подщелачивает; нитраты не восстанавливает. Из источников углерода ассимилирует: глюкозу, сахарозу, галактозу, миннозу, раффинозу, крахмал, сорбит, глицерин. На МПА образует белые гладкие блестящие колонии, профиль равномерно возвышающийся, край ровный, диаметр 2,0-2,5 мм. Из нефтепродуктов хорошо растет на нефти, мазуте, дизельном топливе, рафинате, масле, парафинах широкой фракции. Содержание Г+Ц в ДНК 40 - 47 мол.%. Растет в пределах температур 6-20oC, при pH среды 6,8-7,6. Штамм непатогенен, нетоксичен и не вирулентен. Хранится на косяках МПА и в лиофилизированном состоянии на защитной среде Файбич при температуре +4oC.

Pseudomonas fluorescens штамм 325 ВКПМ-В-7152 - грамотрицательные слабоподвижные короткие и длинные палочки, одиночные, реже сдвоенные или слегка изогнутые размером 0,7х5,0, 1,05х2,1, 0,7х3,5 мкм, размножаются делением - перетяжка, каталазоположительные, желатину не разжижает; молоко не свертывает; нитраты не восстанавливает, резко антагонистичен к плесневым грибам из рода Fusarium. Из источников углерода использует: 1-арабинозу, глюкозу, сахарозу, галактозу, маннит, сорбит, этиловый спирт. На МПА образует серовато-белые гладкие блестящие колонии с зеленоватым оттенком с диаметром 2-4 мм, профиль колоний выпуклый, край ровный. Из нефтепродуктов хорошо растет на нефти, мазуте, дизельном топливе, рафинате, масле и парафинах. Не нуждается в факторах роста. Содержание Г+Ц в ДНК 58 - 70 мол.%. Растет в пределах температур 3-15oC, при pH среды 6,8-8,5. Штамм непотогенен, нетоксичен. Хранится на косяках МПА и в лиофилизированном состоянии на защитной среде Файбич при температуре +4oC.

Alcaligenes faecalis штамм 404 ВКПМ-В-7180 - грамотрицательные, толстые, короткие слабоподвижные палочки размером 1,0х1,05, 1,05х1,4, 0,7х1,05, 1,5х1,4, 0,7х0,7 мкм, размножаются делением - каталазо- и оксидазоположительные, желатину не разжижает, молоко не изменяет, подщелачивает, нитраты слабо восстанавливает до нитритов. Из источников углерода использует: глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, арабинозу, маннозу, маннит, сорбит, дульцит. На МПА образует серовато-бежевые гладкие блестящие колонии, профиль колоний выпуклый, хорошо растет на сырой нефти, мазуте, дизельном топливе, рафинате, масле и парафинах. Не нуждается в факторах роста. Содержание Г+Ц в ДНК 57,9 - 70 мол. %. Растет в пределах температур 6-20oC, при pH среды 7,0-8,5. Штамм непатогенен, нетоксичен, невирулентен. Хранится на косяках МПА и в лиофилизированном состоянии на защитной среде Файбич при температуре +4oC.

Чувствительность к антибиотикам изучена с использованием бумажных дисков, содержащих стандартные концентрации: ампициллина, канамицина, карбеницилина, левомицетина, оксацилина, рифампицина, тетрациклина, фузидина, стрептомицина, эритромицина. Данные представлены в табл. 1.

Предлагаемый консорциум культур бактерий в длительном непрерывном процессе устойчив и не вытесняется посторонней микрофлорой, и их можно отличить друг от друга высевом на МПА из одного разведения с различными антибиотиками. Штаммы отличаются по отношению к стрептомицину, левомицетину, фузидину, оксалину (см. табл. 1). Селекционированные природные психрофильные штаммы бактерий стабильны в непрерывном процессе и легко переключаются с одного вида субстрата к другому, время адаптации не более одного часа.

Введение консорциума психрофильных штаммов бактерий ВКПМ-В-7179 штамм 279, ВКПМ-В-7152 штамм 325, ВКПМ-В-7180 штамм 404 в загрязненную почву позволяет повысить скорость биодеструкции при температурах культивирования 3-15oC, при соотношении культур, % (35:40:25)-(30:50:20). Штаммы ВКПМ-В-7179 и ВКПМ-В-7162 более быстрорастущие и выделяют в среду витамины и аминокислоты, что способствует росту штамма ВКПМ-В-7180.

В предлагаемом способе очистки от нефти и нефтепродуктов с помощью консорциума указанных психрофильных штаммов бактерий количество и состав водного раствора минеральных компонентов питания подбирается в зависимости от условий применения по концентрациям основных питательных веществ, определяющих развитие предлагаемых штаммов бактерий, а также с учетом имеющихся их в среде очищаемого объекта.

Пример 1. Использование консорциума психрофильных бактерий для очистки от нефтепродуктов.

Для получения биомассы консорциума штаммов бактерий ВКПМ-В-7179 штамм 279, ВКПМ-В-7152 штамм 325, ВКПМ-В-7180 штамм 404 их выращивают на жидкой среде N10 следующего состава: (NH4)2SO4 - 3 г/л, KH2PO4 - 6,5 г/л, MgSO4х7H2O - 0,7 г/л, FeSO4x7H2O - 12,5 мг/л, ZnSO4x7H2O - 12,5 мг/л, MnSO4х5H2O - 12,5 мг/л.

В качестве единственного источника углерода используют н-парафины Грозненского НПЗ, полученные карбамидной депарафинизацией с высоким содержанием ароматических углеводородов в концентрации 1 мас.%. Засев минеральной среды производился по 0,05 единиц оптической плотности каждого штамма в одну качалочную колбу. В результате культивирования при температуре 3-6oC на качалке с 140 об/мин, pH среды 6,8-7,0, предлагаемый консорциум бактерий ВКПМ-В-7179 штамм 279, ВКПМ-В-7152 штамм 325, ВКПМ-В-7180 штамм 404 обеспечил за 42 ч утилизацию карбамидного парафина на 87%. Удельная скорость деструкции грозненского парафина составила по сумме углеводородов - 0,052 г УГВ нефти/г ч, по общей сумме экстрагируемых веществ - 0,055 г УГВ нефти/г ч. Соотношение компонентов культур в ассоциации при высевах на твердую питательную среду МПА с различными антибиотиками составило соответственно, % (30: 40:25) - (30:50:20).

Пример 2. Способ очистки с помощью психрофильных культур проводился в типовом ферментере рабочим объемом 25 л, при аэрации ферментера воздухом в количестве 3 л/л/мин, температура культивирования 12-15oC, pH среды 6,8-7,0 при скорости протока среды Д-0,2 ч-1. В качестве источника углерода использовали парафин широкой фракции Новокуйбышевского НПЗ 1,5 об.% и 0,5 об.% сырой грозненской нефти. Засев производился всех трех культур по 0,2 единиц оптической плотности. В качестве питательной среды использовали, г/л:

Ортофосфорная кислота (70%) - 2,5

Хлористый калий - 2,09

Сернокислый магний - 0,55

Сернокислое железо - 0,1

Сернокислый цинк - 0,33

Сернокислый марганец - 0,033

Сернокислая медь - 0,012

Азот в виде 6% (NH4)OH - 2,45 г/л

pH среды - 6,8-7,0

Удельная скорость биодеструкции составила 0,198 г УГВ нефти/ г/ч. Выход от заданного сырья - 89,6%, процесс был стабильным и соотношение культур в ассоциации при высевах на твердую питательную среду - МПА с антибиотиками был таким же, как в периодическом культивировании в колбах на качалках, % (30-35):(40-50):(20-25).

Пример 3. Способ очистки от нефтепродуктов проводился в качалочных колбах на морской воде следующего состава:

Ион аммония - следы

Фосфат-ион - следы

Калий - 400 мг/л

Магний - 1500 мг/л

Железо - следы

На 100 мл морской воды добавляли 2 мл грозненской нефти, 60 мг иона аммония (в форме сульфата), 100 мг фосфат-иона (в форме ортофосфорной кислоты), 4 мг железа (в форме сульфата железа семиводного) и 90,0 мг сухой биомассы смеси штаммов бактерий 279, 325 и 404 в соотношении 1:1:1. Культивирование проводилось в течение 120 ч на качалке с 220 об/мин при температуре 12-15oC. Результаты эксперимента представлены в табл. 2.

Таким образом, предлагаемый консорциум психрофильных микроорганизмов обеспечивает повышение скорости утилизации углеводородов при температуре 3-15oC, что позволяет использовать их при очистке загрязнений в северных регионах. Бактерии устойчивы в длительном непрерывном процессе, не нуждаются в дополнительных факторах роста и обеспечивают высокую эффективность очистки от нефтепродуктов как в пресной, так и в морской воде и почве. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Консорциум штаммов бактерий Acinetobacter calcoaceticus et al. ВКПМ-В-7179, Pseudomonas fluorescens Stanier et.al. ВКПМ-В-7152, Alcaligenes faecalis Castellani et Chaliners ВКПМ-В-7180, предназначенный для деструкции нефти и нефтепродуктов.




ПРОЧИТАТЬ НУЖНО ВСЕМ !
Судьба пионерских изобретений и научных разработок, которым нет и не будет аналогов на планете еще лет сорок, разве что у инопланетян



Независимый научно технический портал
Воздухо- и водоочистка. Опреснительные установки






СОВЕРШЕННО БЕСПЛАТНО!
Вам нужна ПОЛНАЯ ВЕРСИЯ данного патента? Сообщите об этом администрации портала. В сообщении обязательно укажите ссылку на данную страницу.


ПОИСК ИНФОРМАЦИИ В БАЗЕ ДАННЫХ


Режим поиска:"и" "или"

Инструкция. Ключевые слова в поле ввода разделяются пробелом или запятой. Регистр не имеет значения.

Режим поиска "и" означает, что будут найдены только те страницы, где встречается каждое из ключевых слов. Например, при запросе "очистка воды" будет найдено словосочетание "очистка воды". При использовании режима "или" результатом поиска будут все страницы, где встречается хотя бы одно ключевое слово ("очистка" или "воды").

В любом режиме знак "+" перед ключевым словом означает, что данное ключевое слово должно присутствовать в найденных файлах. Если вы хотите исключить какое-либо слово из поиска, поставьте перед ним знак "-". Например: "+очистка -воды".

Поиск выдает все данные, где встречается введенное Вами слово. Например, при запросе "сток" будут найдены слова "стоков", "стоки" и другие. Восклицательный знак после ключевого слова означает, что будут найдены только слова точно соответствующие запросу "сток!".


Устройства и способы водоочистки | Опреснительные установки. Дистилляторы | Устройства и способы воздухоочистки


Рейтинг@Mail.ru