СОЕДИНЕНИЯ, АКТИВНЫЕ ПРИ НОВОМ САЙТЕ НА ОПЕРИРУЕМЫХ РЕЦЕПТОРОМ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛАХ, ПРИМЕНИМЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ
(51) 7 A61K31/137, A61K31/395, C07C211/26, C07C211/27, C07D227/00, A61P25/00
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 28.06.2007 - действует
--------------------------------------------------------------------------------
Документ: В формате PDF
(14) Дата публикации: 2005.02.20
(21) Регистрационный номер заявки: 98100454/15
(22) Дата подачи заявки: 1996.06.07
(30) Приоритетные данные: 08/485,038 1995.06.07 US
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1996.06.07
(43) Дата публикации заявки: 2000.01.27
(45) Опубликовано: 2005.02.20
(56) Аналоги изобретения: US 4018895 А, 19.04.1997. ЕР 399504 A1, 28.11.1990. US 5382600 A, 17.01.1995. WO 9304373 A1, 04.03.1993. US 5310756 А, 10.05.1994. JP 03056415 A, 12.03.1991. БД Lexis-Nexis, реферат, HELKE et al., Antiextensor effects of 3,3 - diphenyl - n - Propylamin in the mouse, Eur. J. of Pharmacology, vol. 48, 1978, p.231-235. МАШКОВСКИЙ М.Д., Лекарственные средства, М., Медицина, 1993, ч.1, с.125. БД Lexis-Nexis, реферат, PALMER G.C., Anticonvulsant properties of calcium channel b lockers in mice, Epilepsia, 1993, vol. 34, №2, p.372-380.
(72) Имя изобретателя: Алан Л. МЮЛЛЕР (US); Скотт Т. МОЭ (US); Мануэл Ф. БАЛАНДРИН (US); Эрик Дж. ДЕЛМАР (US); Бредфорд К. ВАНВАГЕНЕН (US); Линда Д. АРТМАН (US); Роберт М. БАРМОР (US); Дэрил Л. СМИТ (US)
(73) Имя патентообладателя: ЭН-ПИ-ЭС ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 1998.01.08
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: US 96/10201 (07.06.1996)
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 96/40097 (19.12.1996)
(98) Адрес для переписки: 129010, Москва, ул. Б.Спасская, 25, стр.3, ООО "Юридическая фирма Городисский и Партнеры", пат.пов. Е.Е.Назиной
(54) СОЕДИНЕНИЯ, АКТИВНЫЕ ПРИ НОВОМ САЙТЕ НА ОПЕРИРУЕМЫХ РЕЦЕПТОРОМ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛАХ, ПРИМЕНИМЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ
Изобретение относится к области неврологии. Описаны арилалкиламины, специфически действующие на определенные типы оперируемых рецепторами Са2+-каналов, их применение и фармацевтические композиции для лечения неврологических расстройств или заболеваний. 6 н. и 49 з.п. ф-лы, 11 табл.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данная заявка является частичным продолжением находящейся на одновременном рассмотрении заявки U.S. Serial No. 08/485038, поданной 7 июня 1995 года, которая является частичным продолжением одновременно рассматриваемой Международной патентной публикации No. PCT/US94/12293, поданной 26 октября 1994 года, которая является частичным продолжением одновременно рассматриваемой заявки U.S. Serial No. 08/288688, поданной 9 августа 1994 года, которая является частичным продолжением ожидающей одновременного рассмотрения заявки U.S. Serial No. 08/194210, поданной 8 февраля 1994 года, которая является частичным продолжением U.S. Serial No. 08/014813, поданной 8 февраля 1993 года, в настоящее время абандонированной. Все они включены здесь в качестве ссылок во всей их полноте.
Область изобретения
Данное изобретение относится к соединениям, которые могут использоваться в качестве нейропротекторов, антиконвульсивных средств, транквилизаторов, аналгетиков, миорелаксантов или адъювантов для общих анестетиков. Данное изобретение относится также к способам, которые могут использоваться для лечения неврологических нарушений и заболеваний, в том числе, но не только, общего и очагового ишемического и геморрагического удара (внезапного приступа), повреждения спинного мозга, индуцированного гипоксией повреждения нервных клеток, такого как остановка сердца или неонатальный дистресс, эпилепсии, состояния тревоги и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Хангтингтона, болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз (ALS). Данное изобретение относится также к способам скрининга на соединения, активные при новом сайте на оперируемых рецепторами кальциевых каналах и вследствие этого имеющие терапевтическую применимость в качестве нейропротекторов, антиконвульсивных средств, транквилизаторов, аналгетиков и/или имеющие потенциальную терапевтическую применимость для лечения неврологических нарушений и заболеваний, описанных выше.
Предпосылки изобретения
Далее следует описание родственной области знаний, причем ни один из приводимых примеров не является прототипом пунктов формулы изобретения.
Глутамат представляет собой основной нейротрансмиттер (нейромедиатор) возбуждения в мозгу млекопитающего. Глутамат связывается или взаимодействует с одним или несколькими рецепторами глутамата, которые можно дифференцировать фармакологически на несколько подтипов. В центральной нервной системе млекопитающего (ЦНС) имеется три основных подтипа ионотропных рецепторов глутамата, определяемых фармакологически при помощи селективных агонистов N-метил-D-аспартата (NMDA), каината (КА) и -амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовой кислоты (АМРА). Считалось, что NMDA-рецептор принимает участие во многих неврологических патологиях, в том числе во внезапном приступе (инсульте), травме головы, повреждении спинного мозга, эпилепсии, состоянии тревоги и нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера (Watkins and Collingridge. The NMDA Receptor, Oxford: IRL Press, 1989). Роль рецепторов NMDA в восприятии боли и аналгезии была также хорошо постулирована (Dickenson, A cure for wind-up: NMDA receptor antagonists as potential analgesics. Trends Pharmacol. Sci. 11: 307, 1990). Более недавно широко исследовались АМРА-рецепторы на их возможное участие в таких нейрологических патологиях (Fischer and Bogousslavsky, Evolving toward effective therapy for acute ischemic stroke. J. Amer. Med. Assoc. 270: 360, 1993; Yamaguchi et al., Anticonvulsant activity of AMPA/kainate antagonists: Comparison of GYKI 52466 and NBQX in maximal electroshok and chemoconvulsant seizure models. Epilepsy Res. 15: 179, 1993).
При активации глутаматом эндогенный нейротрансмиттер, рецептор NMDA, делает возможным приток внеклеточного кальция (Са2+) и натрия (Na+) через ассоциированный ионный канал. NMDA-рецептор делает возможным значительно больший приток Са2+, чем каинатный или АМРА-рецепторы (см. ниже), и является примером оперируемого рецептором Са2+ -канала. В норме этот канал является открытым только недолго, позволяя локализованное и временное увеличение концентрации внутриклеточного Са2+ ([Са2+]), которая, в свою очередь, изменяет функциональную активность этой клетки. Однако пролонгированные увеличения [Са2+]i, происходящие из-за хронической стимуляции NMDA-рецептора, являются токсическими для клетки и приводят к гибели клетки. Считают, что хроническое повышение [Ca2+]i, происходящее в результате стимуляции NMDA-рецепторов, является первичной причиной дегенерации нейронов после инсульта (удара) (Choi, Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron 1: 623, 1988). Считают также, что сверхстимуляция NMDA-рецепторов участвует в патогенезе некоторых форм эпилепсии (Dingledine et al., Excitatory amino acid receptors in epilepsy. Trends Pharmacol. Sci. 11:334, 1990), состоянии тревоги (Wiley and Dalster, Preclinical evaluation of N-methyl-D-aspartate antagonists for antianxiety effects: A review. In: Multiple Sigma and PCP Receptor Ligands: Mechanisms for Neuromodulation and Neuroprotection? NPP Books, Ann Arbor, Michigan, pp.801-815, 1992), нейродегенеративных заболеваний (Meldrum and Garthwaite, Excitatory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative disease. Trends Pharmacol. Sci. 11: 379, 1990) и гипералгезических состояниях (повышенной болевой чувствительности) (Dickenson, A cure for wind-up: NMDA receptor antagonists as potential analgesics. Trends Pharmacol. Sci. 11: 307, 1990).
Активность комплекса NMDA-рецептор-ионофор регулируется множеством модуляторных сайтов, на которые могут быть нацелены селективные антагонисты. Конкурентные антагонисты, такие как фосфонат АР5, действуют при глутаматсвязывающем сайте, тогда как неконкурентные антагонисты, такие как фенциклидин (РСР), МК-801 или магний (Mg 2+), действуют внутри ассоциированного ионного канала (ионофора). Имеется также сайт связывания глицина, который может селективно блокироваться такими соединениями, как 7-хлоркинуреновая кислота. Имеется доказательство, предполагающее, что глицин действует как коагонист, так что как глутамат, так и глицин являются необходимыми для индукции полных опосредованных NMDA-рецептором ответных реакций. Другие потенциальные сайты модулирования функции NMDA-рецептора включают цинк (Zn2+)-связывающий сайт и сигма-лигандсвязывающий сайт. Кроме того, считают, что эндогенные полиамины, такие как спермин, связываются со специфическим сайтом и таким образом усиливают функцию NMDA-рецептора (Ransom and Stec, Cooperative modulation [3H]MK-801 binding to the NMDA receptorion channel complex by glutamate, glycine and polyamines. J. Neurochem. 51:830, 1988). Потенциирующий эффект полиаминов на функцию NMDA-рецептора может быть опосредован через специфический рецепторный сайт для полиаминов; были описаны полиамины, демонстрирующие агонистическую, антагонистическую и обращенную агонистическую активность (Reynolds, Arcaine is a competitive antagonist of the polyamine site on the NMDA receptor. Europ. J. Pharmacol. 177: 215, 1990; Williams et al., Characterization of polyamines having agonist, antagonist, and inverse agonist effects at the polyamine recognition site of the NMDA receptor. Neuron 5: 199, 1990). Исследования связывания радиолиганда продемонстрировали дополнительно, что более высокие концентрации полиаминов ингибируют функцию NMDA-рецептора (Reynolds and Miller, Ifenprodil is a novel type of NMDA receptor antagonist: Interaction with polyamines. Molec. Pharmacol. 36: 758, 1989; Williams et al., Effects of polyamines on the binding of [ 3H]MK-801 to the NMDA receptor: Pharmacological evidence for the existence of a polyamine recognition site. Molec. Pharmacol. 36: 575, 1989; Sacaan and Johnson, Characterization of the stimulatory and inhibitory effects of polyamines on [3H]TCP binding to the NMDA receptor-ionophore complex. Molec. Pharmacol. 37: 572, 1990). Это ингибиторное действие полиаминов на NMDA-рецепторы является, возможно, неспецифическим эффектом (т.е. не медиированным через рецептор полиамина), поскольку электрофизиологические исследования (пэтч-кламп, patch-clamp)) показали, что это ингибирование осуществляется соединениями, которые, как показано ранее, действуют при рецепторе полиамина либо как агонисты, либо как антагонисты (Donevan et al., Arcaine Blocks N-Methyl-D-Aspartate Receptor Responses by an Open Channel Mechanism: Whole-Cell and Single-Channel Recording Studies in Cultured Hippocampal Neurons. Molec. Pharmacol. 41: 727, 1992; Rock and Macdonald, Spermine and Related Polyamines Produce a Voltage-Dependent Reduction of NMDA Receptor Single-Channel Conductance. Volec. Pharmacol. 42: 157, 1992).
Недавние исследования показали молекулярное разнообразие рецепторов глутамата (описанных в обзоре Nakanishi, Molecular Diversity of Glutamate Receptors and Implications for Brain Function. Science 258: 597, 1992). К настоящему времени были идентифицированы по меньшей мере пять отличающихся субъединиц NMDA-рецептора (NMDAR1 и NMDAR2A - NMDAR2D), каждая из которых кодируется отдельным геном. Также в NMDAR1 альтернативный сплайсинг дает по меньшей мере шесть дополнительных изоформ. По-видимому, NMDAR1 является необходимой субъединицей и комбинирование NMDAR1 с различными членами форм NMDAR2 образует полностью функциональный комплекс NMDA-рецептор-ионофор. Комплекс NMDA-рецептор-ионофор, таким образом, может быть определен как гетероолигомерная структура, состоящая по меньшей мере из субъединиц NMDAR1 и NMDAR2; существование дополнительных, еще не идентифицированных, субъединиц не исключается этим определением. Было показано, что NMDAR1 обладает сайтами связывания для глутамата, глицина, Мg2+, МК-801 и Zn2+. Сайты связывания для сигма-лигандов и полиаминов не были еще определены на субъединицах NMDA-рецептора, хотя недавно сообщалось, что ифенпродил является более сильным при субъединице NMDAR2B, чем при субъединице NMDAR2A (Williams, Ifenprodil discriminates subtypes of the N-methyl-D-aspartate receptor: selectivity and mechanisms at recombinant heteromeric receptors. Mol. Pharmacol. 44: 851, 1993).
Несколько отдельных подтипов АМРА- и каинатных рецепторов также были клонированы (обзор Nakanishi, Molecular diversity of glutamate receptors and implications for brain function. Science 258: 597, 1992). Особое отношение к данному вопросу имеют АМРА-рецепторы, названные GluR1, GluR2, GluR3 и GluR4 (также называемые GluRA-GluRD), каждый из которых существует в одной из двух форм, названных flip и flop, которые возникают в результате альтернативного сплайсинга РНК. GluR1, GluR3 и GluR4 при экспрессии в виде гомомерных или гетеромерных рецепторов являются проницаемыми для Са2+ , и, следовательно, они являются примерами оперируемых рецепторами Са2+-каналов. Экспрессия только GluR2 одного или в комбинации с другими субъединицами приводит к рецептору, который является в большей мере непроницаемым для Сa2+. Поскольку наиболее нативные АМРА-рецепторы, изученные in situ, являются непроницаемыми для Са2, считают, что такие рецепторы in situ обладают по меньшей мере одной субъединицей GluR2.
Кроме того, высказывается гипотеза, что субъединица GluR2 является функционально отличающейся, благодаря тому факту, что она содержит остаток аргинина в вероятном образующем пору трансмембранном районе II; GluR1, GluR3 и Glu4 содержат (все) остаток глутамина в этом решающем районе (названный сайтом Q/R, где Q и R являются буквенными обозначениями для глутамина и аргинина соответственно). Активность АМРА-рецептора регулируется рядом модуляторных сайтов, на которые могут быть нацелены селективные антагонисты (Honore et al., Quinoxalinediones: potent competitive non-NMDA glutamate receptor antagonists. Science 241: 701, 1988; Donevan and Rogawski, GYKI 52466, a 2,3-benzodiazepine, is a highly selective, noncompetitive antagonist of AMPA/kainate receptor responses. Neuron 10: 51, 1993). Конкурентные антагонисты, такие как NBQX, действуют при сайте связывания глутамата, тогда как такие соединения, как GYKI 52466, действуют, по-видимому, неконкурентно при ассоциированном с ними аллостерическом сайте.
Сообщается, что соединения, действующие как конкурентные или неконкурентные антагонисты при NMDA-рецепторе, являются эффективными в предотвращении гибели нервных клеток в различных тестах нейротоксичности in vitro (Meldrum and Garthwaite, Excitatory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative disease. Trends Pharmacol. Sci. 11: 379, 1990) и в моделях in vivo удара (острого внезапного приступа) (Scatton, Therapeutic potential of NMDA-receptor antagonists in ischemic cerebro-vascular disease in Drug Strategies in the Prevention and Treatment of Stroke, IBC Technical Services Ltd., 1990). Такие соединения являются также эффективными противосудорожными средствами (Meldrum, Excitatory amino acid neurotransmission in epilepsy and anticonvulsant therapy in Excitatory Amino Acids. Meldrum, Moroni, Simon, and Woods (Eds.), New York: Raven Press, p.655, 1991), транквилизаторами (Wiley and Balster, Preclinical evaluation of N-methyl-D-aspartate antagonists for antianxiety effects: A review. In: Multiple Sigma and PCP Receptor Ligands: Mechanisms for Neuromodulation and Neuroprotection? NPP Books, Ann Arbor, Michigan, pp.801-815, 1992), и аналгетиками (Dickenson, A cure for wind-up: NMDA receptor antagonists as potential analgesics. Trends Pharmacol. Sci. 11: 307, 1990), и некоторые антагонисты NMDA-рецептора могут ослаблять деменцию, связанную с болезнью Альцгеймера (Hughes, Merz's novel approach to the treatment of dementia. Script No. 1666: 24, 1991).
Подобным образом, антагонисты АМРА-рецептора были подвергнуты интенсивному критическому изучению в качестве потенциальных терапевтических агентов для лечения таких неврологических нарушений и заболеваний. Было показано, что антагонисты АМРА-рецепторов обладают нейропротекторной (Fischer and Bogousslavsky, Evolving toward effective therapy for acute ischemic stroke. J. Amer. Med. Assoc. 270: 360, 1993), противосудорожной (Yamaguchi et al., Anticonvulsant activity of AMPA/kainate antagonists: comparison of GYKI 52466 and NBQX in maximal electroshock and chemoconvulsant seizure models. Epilepsy Res. 15: 179, 1993) активностью в моделях животных ишемического удара и эпилепсии соответственно.
Никотиновый холинергический рецептор, присутствующий в ЦНС млекопитающих, является другим примером оперируемого рецептором Са2+ -канала (Deneris et al., Pharmacological and functional diversity of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Trends Pharmacol. Sci. 12: 34, 1991). Были клонированы отличающиеся субъединицы рецептора, и эти субъединицы могут экспрессироваться, например, в ооцитах Xenopus с образованием функциональных рецепторов с их катионными каналами. Высказывается гипотеза, что такие комплексы рецептор-ионофор являются гетеропентамерными структурами. Возможная роль оперируемых рецепторами Са2+-каналов в патологии неврологических нарушений и заболеваний, таких как ишемический удар, эпилепсия и нейродегенеративные заболевания, в большой степени остается невыясненной.
Ранее было показано, что некоторые яды пауков и ос содержат арилалкиламиновые токсины (также называемые полиаминовыми токсинами, ариламиновыми токсинами, ацилполиаминовыми токсинами или полиаминамидными токсинами) с активностью против рецепторов глутамата в ЦНС млекопитающих (в качестве обзоров см. Jackson and Usherwood, Spider toxines as tools for dissecting elements of excitatory amino acid transmission. Trends Neurosci. 11: 278, 1988; Jackson and Parks, Spider Toxins: Recent Applications in Neurobiology. Annu. Rev. Neurosci. 12: 405, 1989; Saccomano et al., Polyamine spider toxins: Unique pharmacological tools. Annu. Rep. Med. Chem: 24: 287, 1989; Usherwood and Bladbrough, Spider Toxines Affecting Glutamate Receptors: Polyamines in Therapeutic Neurochemistry, Pharmacol. Therap. 52:245, 1991: Kawai, Neuroactive Toxins of Spider Venoms. J. Toxicol. Toxin Rev. 10: 131, 1991). Вначале сообщалось, что арилалкиламиновые токсины являются селективными антагонистами АМРА/каинатных подтипов глутаматных рецепторов в ЦНС млекопитающих (Kawai et al., Effect of a spider toxin on glutaminergic synapses in the mammalian brain. Biomed. Res. 3: 353, 1982; Saito et al., Spider Toxin (JSTX) blocks glutamate synapse in hippocampal pyramidal neurons. Brain Res. 346: 397, 1985; Saito et al., Effects of a spider toxin (JSTX) on hippocampal CA1 neurons in vitro. Brain Res. 481: 16, 1989; Akaike et al., Spider toxin blocks excitatory amino acid responses in isolated hippocampal pyramidal neurons. Neurosci. Lett. 79: 326, 1987; Ashe et al., Argiotoxin-636 blocks excitatory synaptic transmission in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. Res. 480: 234, 1988; Jones et al., Philanthotoxin blocks quisqualate-induced, AMPA-induced and kainate-induced, but not NMDA-induced excitation of rat brainstem neurons in vivo. Br. J. Pharmacol. 101: 968, 1990). Последующие исследования показали, что, хотя некоторые арилалкиламиновые токсины являются не сильнодействующими и неселективными при различных глутаматных рецепторах, другие арилалкиламины являются очень сильнодействующими и селективными при антагонистических ответах, опосредованных активацией NMDA-рецепторов в ЦНС млекопитающих (Mueller et al., Effects of polyamine spider toxines on NMDA receptor-mediated transmission in rat hippocampus in vitro. Soc. Neurosci. Abstr. 15: 945, 1989; Mueller et al., Arylaminefepider toxins antagonize NMDA receptor-mediated synaptic transmission in rat hippocampal slices. Synapse 9: 244, 1991; Parke et al., Polyamine spider toxins block NMDA receptor-mediated increases in cytosolic calcium in cerebellar granule neurons. Soc. Neurosci. Abst. 15: 1169, 1989; Parks et al., Arylamine toxins from funnel-web spider (Agelenopsis aperta) venom antagonize N-methyl-D-aspartate receptor function in mammalian brain. J. Biol. Chem. 266: 21523, 1991; Priestley et al., Antagonism of responses to excitatory amino acids on rat cortical neurones by the spider toxin, argiotoxin-636. Br. J. Pharmacol. 97: 1315, 1989; Draguhn et al., Argiotoxin-636 inhibits NMDA-activated ion channels expressed in Xenopus oocytes. Neurosci. Lett. 132: 187, 1991; Kiskin et al., A highly potent and selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonist from the venom of the Agelenopsis aperta spider, Neuroscience 51: 11, 1992: Brackley et al., Selective antagonism of native and cloned kainate and NMDA receptors by polyamine-containing toxins. J. Pharmacol. Exp. Therap. 266: 1573, 1993; Williaiya, Effects of Agelenopsis aperta toxins in the N-methyl-D-aspartate receptor: Polyamine-like and high-affinity antagonist actions. J. Pharmacol. Exp. Therap. 266: 231, 1993). Также сообщалось ингибирование никотиновых холинергических рецепторов арилалкиламиновым токсином филантотоксином (Rozental et al., Allosteric inhibition of nicotinic acetylcholine receptors of vertebrates and insects by philanthotoxin. J. Pharmacol. Exp. Therap. 249: 123, 1989). Parks et al. (Arylamine toxins from funnel-web spider (Agelenopsis aperta) venom antagonize N-methyl-D-aspartate receptor function in mammalian brain. J. Biol. Chem. 266: 21523, 1991) описывают арилалкиламиновые токсины паука ( -агатоксины), которые являются антагонистами функции NMDA-рецептора в мозгу млекопитающих. Эти авторы обсуждают механизм действия арилалкиламиновых токсинов и показывают, что оперируемый NMDA-рецепторами ионный канал является возможным сайтом действия -агатоксинов и, наиболее вероятно, арилалкиламинов яда других пауков. Они утверждают:
"Открытие, что эндогенные полиамины в мозгу позвоночных модулируют функцию NMDA-рецепторов, предполагает, что ариламиновые токсины могут осуществлять их антагонизм через полиамин-связывающий сайт на глутаматных рецепторах. Brackly et al. исследовали действия спермина и филантотоксина 433 на ответные реакции, индуцируемые применением возбуждающих аминокислот в ооцитах Xenopus, инъецированных мРНК из мозга крысы или цыпленка. Эти авторы сообщили, что при концентрации, более низкой, чем концентрация, являющаяся антагонистической для глутамат-рецепторной функции, как спермин, так и филантотоксин потенциируют действия передающих возбуждение аминокислот и некоторых других нейротрансмиттеров. На основании этих и других данных Brackley et al. предположили, что ариламиновые токсины могут путем неспецифического связывания с мембранами возбуждаемых клеток уменьшать текучесть мембран и изменять функцию рецептора. Обоснованность этой интригующей идеи для функции NMDA-рецептора не находит хорошего подтверждения в двух недавних исследованиях по связыванию. Reynolds сообщил, что аргиотоксин 636 ингибирует связывание [3H]MK-801 с мембранами мозга крысы способом, который является нечувствительным к глутамату, глицину или спермидину. Этот автор сделал вывод, что аргиотоксин 636 проявляет новое ингибиторное действие на комплекс NMDA-рецептора путем связывания с одним из сайтов Мg 2+, локализованных в ионном канале с NMDA-воротами. Данные по связыванию, сообщенные Williams et al., поддерживают вывод, что аргиотоксин 636 не действует первично в модуляторном сайте полиамина на NMDA-рецепторе, а скорее действует непосредственно путем образования зависимого от активности блока ионного канала. Уже известно, что такие соединения, как фенциклидин и кетамин, могут блокировать ионные каналы, связанные с мышечными глутаматными рецепторами членистоногих и NMDA-рецепторами млекопитающих. Таким образом, представляется возможным, что глутаматные рецепторы позвоночных и беспозвоночных имеют общие дополнительные сайты связывания для аллостерических модуляторов функции рецептора, возможно, родственные сайтам связывания двухвалентных катионов. Понятно, что необходимы значительные дополнительные исследования для определения, определяют ли ариламины такой новый регуляторный сайт".
Usherwood and Blagbrough (Spider Toxins Affecting Glutamate Receptors: Polyaminesin Therapeutic Neurochemistry. Pharmacol. Therap. 52: 245, 1991) описывают предполагаемый внутриклеточный сайт связывания для арилалкиламиновых токсинов (полиаминамидных токсинов), расположенный в поле мембранного потенциала, называемом фильтром селективности QUIS-R-канала. Эти авторы постулируют, что сайт связывания для полиаминамидных токсинов может встречаться вблизи внутреннего входа канала с воротами QUIS-R мышцы саранчи. Авторы также отмечают, что один такой токсин, аргиотоксин-636, является селективным антагонистом NMDA-рецептора в культивируемых кортикальных нейронах крысы.
Gullak et al. (CNS binding sites of the novel NMDA-antagonist Arg-636. Soc. Neurosci. Abst. 15: 1168, 1989) описывают аргиотоксин-636 (Arg-636) как полиаминовый (арилалкил-аминовый) компонент токсина яда паука. Указывается, что этот токсин ингибирует индуцируемое NMDA повышение цГМФ неконкурентным способом. Авторы утверждают, что:
"[125 I]Аrg-636 связывался с мембранами переднего мозга крысы с величинами Kd и Вmах 11,25 мкМ и 28,95 пмоль/мг белка (со специфичностью 80%). Способность других известных полиаминов и недавно обнаруженных полиаминов из Agelenopsis aperta ингибировать связывание соответствовала нейроактивности функциональных антагонистов NMDA. Никакие другие испытанные соединения не были способны ингибировать специфическое связывание".
Затем эти авторы утверждают, что полиамины (арилалкил-амины) могут быть антагонистами в отношении ответов на NMDA посредством взаимодействия с мембранными ионными каналами.
Seymour and Mena (In vivo NMDA antagonist activity of the polyamine spider venom component, argiotoxm-636. Soc. Neurosci. Abst. 15: 1168, 1989) описывают исследования, которые должны были показать, что аргиотоксин-636 не влияет значительно на локомоторную активность при дозах, которые являются эффективными против аудиосенсорных эпилептических припадков у мышей DBA/2, и что он значительно противодействует NMDA-индуцируемым приступам эпилепсии с минимальной эффективной дозой 32 мг/кг, вводимой подкожно (s.c.).
Herold and Yakash (Anesthesia and muscle relaxation with intrathecal injections of AR636 and AG489, two acylpolyamine spider toxins, in rats. Anesthesiology 77: 507, 1992) описывают исследования, которые показывают, что арилалкиламиновый аргиотоксин-636 (ARG636), но не агатоксин-489 (AG489) производит миорелаксацию и анестезию после внутриоболочечного введения в крыс.
Williams (Effects of Agelenopsis aperta toxins on the N-methyl-D-aspartate receptor: Polyamine-like and high-affinity antagonist actions. J. Pharmacol. Exp. Therap. 266: 231, 1993) сообщает, что -агатоксины (арилалкиламины) Agel-489 и Agel-505 усиливают связывание [3H]MK-801 с NMDA-рецепторами на мембранах, полученных из мозга крысы, посредством действия при стимуляторном полиаминовом рецепторе; агонисты полиаминового рецептора устраняли стимуляторные действия Agel-489 и Agel-505, а антагонисты полиаминового рецептора ингибировали стимуляторное действие Agel-505. Более высокие концентрации Agel-489 и Agel-505 и аргиотоксин-636 при всех испытанных концентрациях проявляли ингибирующие действия на связывание [3H]MK-801. В ооцитах Xenopus с зажимами с напряжением при -70 мВ Agel-505 ингибировал ответы на NMDA с IC50 13 нМ; это действие Agel-505 имело место при концентрациях, приблизительно в 10000 раз более низких, чем концентрации, влияющие на связывание [ 3H]MK-801. Ответные реакции на каинат ингибировались только на 11% 30 нМ Agel-505. Антагонизм Agel-505 в отношении NMDA-индуцируемых токов сильно зависел от напряжения, что согласуется с ингибирующим действием на открытые каналы этого токсина. Williams утверждает:
"Хотя -агатоксины могут взаимодействовать при положительном аллостерическом сайте полиамина на NMDA-рецепторе, стимулирующие действия, производимые этим взаимодействием, могут маскироваться в функциональных тестах вследствие отдельного действия этих токсинов в качестве высокоаффинных, неконкурентных антагонистов этого рецептора".
Brackley et al. (Selective antagonism of native and cloned kainate and NMDA-receptors by polyamine-containing toxins, J. Pharmacol. Exp. Therap. 266: 1573, 1993) сообщили, что полиаминсодержащие токсины (арилалкиламины) филантотоксин-343 (PhTX-343) и аргиотоксин-636 (Arg-636) производят обратимое, неконкурентное, частично потенциал-зависимое антагонистическое действие на индуцируемые каинатом и NMDA токи в ооцитах Xenopus, инъецированных РНК мозга крысы. Было показано, что Arg-636 является селективным для индуцируемых NMDA ответов (IС50=0,7 мкМ), тогда как PhTX-343 был селективным для индуцируемых каинатом ответов (IC50=0,12 мкМ) по сравнению с NMDA-индуцируемыми ответами (IС50=2,5 мкМ). Аrg-636 более сильно противодействовал ответам на NMDA в ооцитах Xenopus, экспрессирующих клонированные субъединицы NMDAR1 (IC50=0,05 мкМ), чем ответам на каинат в ооцитах, экспрессирующих клонированные субъединицы GluR1 (IС50 =3,4 мкМ) или субъединицы GluR1+GluR2 (IC50=300 мкМ). РhТХ-343, с другой стороны, был эквипотентным при противодействии NMDAR1 (IС50=2,19 мкМ) и GluR1 (IC50=2,8 мкМ), но гораздо менее сильным против субъединиц GluR1+GluR2 (IС50=270 мкМ).
Raditsch et al. (Subunit-specific block of cloned NMDA receptors by argiotoxin-636. FEBS Lett. 324: 63, 1993) сообщили, что Arg-636 более сильно противодействует ответам в ооцитах Xenopus, экспрессирующих субъединицы NMDAR1+NMDAR2A (IС50=9 нМ) или субъединицы NMDAR1+NMDAR2 С (IС 50=460 нМ), даже хотя все эти субъединицы рецептора содержат остаток аспарагина в вероятном образующим пору трансмембранном районе II (сайте Q/R, обсужденном выше). Авторы утверждают, что большое различие в чувствительности к Arg-636 между каналами NMDAR1+NMDAR2A и NMDAR1+NMDAR2C "должно создаваться другими структурными детерминантами".
Herlitz et al. (Argiotoxin detects molecular differences in AMPA receptor channels. Neuron 10: 1131, 1993) сообщают, что Arg-636 является антагонистом подтипов АМРА-рецепторов с потенциал-зависимым и зависимым от использования действием, что согласуется с ингибированием открытых каналов. Arg-636 сильно противодействует проницаемым для Са2+ АМРА-рецепторам состоящим из субъединиц GluRAi (Ki =0,35 мкМ), GluRCi (Ki=0,23 мкМ) или GluRDi (K i=0,43 мкМ), хотя является по существу неэффективным против непроницаемых для Са2+ субъединиц GluRBi при концентрациях до 11 мкМ. Другие данные, сообщаемые этими исследователями, убедительно подтверждают предположение, что сайт Q/R в предполагаемом образующем пору трансмембранном районе II имеет первичное значение в определении силы Аrg-636 и проникаемости Са2+.
Blaschke et al. (A single amino acid determines the subunit-specific spider toxin block of -amino-3-hydroxy-5-methylisoxasol-4-propionate/kainate receptor channels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6528, 1993) сообщают, что арилалкиламин JSTX-3 сильно противодействует ответам на каинат в ооцитах Xenopus, экспрессирующих субъединицы GluR1 (IC 50=0,04 мкМ) или GluR3 (IC50=0,03 мкМ), но на экспрессируемые рецепторы, в которых присутствует субъединица GluR2, по существу не действует этот токсин. Исследования с сайт-направленным мутагенезом дают убедительные указания на то, что сайт Q/R является первичным сайтом, влияющим на силу токсина.
Nakanishi et al. (Bioorganic studies of transmitter receptors with philanthotoxin analogs. Pure Appl. Chem., in press) синтезировали ряд очень сильнодействующих фотоаффинно меченных аналогов филантотоксина (PhTX). Такие аналоги исследовались на экспрессируемых никотиновых холинергических рецепторах в качестве модельной системы для оперируемых рецепторами кальциевых каналов. Эти исследователи предполагают, что эти аналоги PhTX блокируют ионный канал гидрофобным головным участком токсина, связывающимся с сайтом вблизи цитоплазматической поверхности, тогда как полиаминовый хвост простирается в ионный канал со стороны цитоплазмы.
Сущность изобретения
Заявителем были исследованы разнообразные по структуре и биологической активности арилалкиламины (иногда называемые ариламиновыми токсинами, полиаминовыми токсинами, ацилполиаминовыми токсинами или полиаминамидными токсинами) в яде пауков и ос и обнаружено, что некоторые из арилалкиламинов, присутствующих в этих ядах, действуют как сильные неконкурентные антагонисты оперируемых глутаматным рецептором Са2+ -каналов в центральной системе млекопитающих. Хотя эти арилалкиламиновые соединения содержат в их структуре полиаминовую часть, они не похожи на другие известные простые полиамины в связи с тем, что они обладают чрезвычайно сильными и специфическими действиями на определенные типы оперируемых рецепторами Са2+-каналов.
С использованием нативных арилалкиламинов в качестве ведущих (основных) структур синтезировали и испытали ряд аналогов. Первоначальные открытия на арилалкиламинах, выделенных и очищенных из яда, были подтверждены с применением синтетических арилалкиламинов. Эти соединения являются небольшими молекулами (мол. масса < 800) с продемонстрированной эффективностью в моделях in vivo ишемического удара и эпилепсии. В качестве модели оперируемых рецепторами Са2+-каналов использовали комплекс NMDA-рецептор-ионофор. Было показано, что выбранные арилалкиламины ингибируют опосредованные NMDA-рецептором ответы по новому механизму. Кроме того, уникальный поведенческий фармакологический профиль этих соединений предполагает, что они вряд ли индуцируют РСР-подобную психодисплетическую (галлюциногенную) активность и нарушение познавательной способности, которые характеризуют другие ингибиторы NMDA-рецептора. Наконец, арилалкиламины являются уникальными среди антагонистов NMDA-рецептора в том смысле, что они способны противодействовать определенным подтипам клонированных и экспрессированных АМРА-рецепторов, а именно тем, которые проницаемы для Са2+. Следовательно, арилалкиламины являются единственным известным классом соединений, способных противодействовать опосредованным глутаматным рецептором увеличениям цитозольного Са2+ , независимо от фармакологического определения подтипа рецептора. Кроме того, арилалкиламины ингибируют оперируемый другим рецептором Са2+-канал никотиновым холинергическим рецептором. Если избыточные и пролонгированные увеличения количества цитозольного Са2+ связывали с этиологией нескольких неврологических нарушений и заболеваний, такие арилалкиламины являются ценными, являющимися маленькими молекулами, исходными материалами для разработки новых терапевтических средств для различных неврологических нарушений и заболеваний.
Заявитель определил, что выбранные арилалкиламины связываются с высокой аффинностью при новом сайте на комплексе NMDA-рецептор-ионофор, который до настоящего времени не был идентифицирован, и что арилалкиламины не связываются с высокой аффинностью при любых известных сайтах (глутаматсвязывающем сайте, глицинсвязывающем сайте, МК-801-связывающем сайте, Мg 2+-связываюшем сайте, Zn2+-связывающем сайте, полиаминсвязывающем сайте, сигма-связывающем сайте) на комплексе NMDA-рецептор-ионофор. Это определение позволило заявителю разработать способы и протоколы, при помощи которых могут быть идентифицированы соединения, которые обеспечивают как терапевтически применимые соединения, так и исходные соединения для разработки других терапевтически применимых соединений. Эти соединения могут быть идентифицированы при помощи скрининга на соединения, которые связываются при новом сайте связывания арилалкиламина, и путем определения, имеет ли такое соединение требующиеся биологические, фармакологические и физиологические свойства.
Способ включает стадию идентификации соединения, которое связывается с оперируемым рецептором Са 2+-каналом при сайте, связываемом арилалкиламиновыми соединениями, названными здесь как соединение 1, соединение 2 или соединение 3 и имеющими структуру, показанную ниже.
Под "терапевтически применимым соединением" имеют в виду соединение, которое потенциально применимо в лечении нарушения или патологического состояния. Соединение, обнаруживаемое этим способом скрининга, характеризуется как имеющее потенциальную терапевтическую применимость в лечении, поскольку еще не были проведены клинические тесты для определения действительной терапевтической применимости.
Под "неврологическим нарушением или заболеванием" имеют в виду нарушение или заболевание нервной системы, в том числе (но не только) глобальный или очаговый ишемический или геморрагический удар, травму головы, повреждение спинного мозга, ишемию спинного мозга, индуцированное ишемией или гипоксией повреждение нервных клеток, вызываемое гипоксией повреждение нервных клеток, например, при остановке сердца или неонатальном дистрессе, эпилепсию, состояние тревоги, нейропсихиатрические заболевания или нарушения познавательной способности вследствие ишемии или гипоксии, такие как нарушения, которые часто встречаются как следствие хирургии сердца при экстракорпоральном (искусственном) кровообращении, и нейродегенеративное заболевание. Под "неврологическим нарушением или заболеванием" подразумевают также такие болезни и состояния, при которых могут быть показаны, полезны, рекомендованы или предписаны нейропротекторы, антиконвульсивные средства, транквилизаторы, аналгетики, миорелаксанты и/или вспомогательные средства в общей анестезии.
Под "нейродегенеративным заболеванием" подразумевают заболевания, включающие (но не только) болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз (ALS).
"Под "нейропротектором" имеют в виду соединение, способное предотвращать повреждение или гибель нейронов, связанные с неврологическим нарушением или заболеванием.
Под "противосудорожным средством" подразумевают соединение, способное к уменьшению судорог, вызываемых такими состояниями, как простые парциальные эпилептические припадки, сложные парциальные эпилептические припадки, эпилептический статус и вызванные травмой эпилептические припадки, которые встречаются после повреждения головы, в том числе хирургии головы.
Под "трансквилизатором" подразумевают соединение, способное облегчать боль путем изменения восприятия болевых стимулов, без индуцирования анестезии или потери сознания.
Под " миорелаксантом" имеют в виду соединение, которое уменьшает мышечное напряжение.
Под "вспомогательным средством в общей анестезии" имеют в виду соединение, применимое в соединении с анестезирующими агентами, в индуцировании потери способности воспринимать боль, связанной с потерей сознания.
Под "сильнодействующим" или "активным" имеют в виду, что соединение имеет активность при оперируемых рецепторами кальциевых каналах, в том числе NMDA-рецепторах, Са2+-проникаемых АМРА-рецепторах и никотиновых холинергических рецепторах, с величиной IС50 менее 10 мкМ, более предпочтительно менее 100 нМ и даже более предпочтительно менее 1 нМ.
Под термином "селективный" имеют в виду, что соединение является сильнодействующим при оперируемых рецепторами кальциевых каналах, как описано выше, но является в 10 раз менее сильнодействующим, более предпочтительно в 50 раз и даже более предпочтительно в 100 раз менее сильнодействующим при других нейротрансмиттерных рецепторах, оперируемых нейротрансмиттерными рецепторами ионных каналах или потенциалзависимых ионных каналах.
Под "биохимическими и электрофизиологическими тестами функции оперируемых рецепторами кальциевых каналов" имеют в виду тесты, предназначенные для обнаружения биохимическими или электрофизиологическими средствами функциональной активности оперируемых рецепторами кальциевых каналов. Примеры таких тестов включают, но не только, fura-2-флуорометрический тест для цитозольного кальция в культивируемых зернистых клетках мозжечков крыс (см. пример 1 и пример. 2), электрофизиологические тесты (patch сlаmр="пэтч-кламп") (см. пример 3 и пример 27), тесты синаптической передачи возбуждения на срезах гиппокампа (см. пример 5), тесты связывания радиолигандов (см. пример 4, пример 24, пример 25 и пример 26) и нейропротекторные тесты in vitro (см. пример 6).
Под "эффективностью" подразумевают, что с выбранным соединением детектируется значимый уровень желаемой активности; под "значимым" имеют в виду статистическую значимость при уровне р<0,05.
Под "нейропротекторной активностью" подразумевают эффективность в лечении неврологических нарушений или заболеваний, в том числе, но не только, глобального и очагового ишемического и геморрагического удара, травмы головы, повреждения спинного мозга, ишемии спинного мозга, индуцируемого ишемией или гипоксией повреждения нервных клеток, индуцируемого гипоксией повреждения нервных клеток, например, при остановке сердца или неонатальном дистрессе, нейропсихиатрических нарушений или нарушений познавательной способности вследствие ишемии или гипоксии, таких как нарушения, которые часто встречаются как следствие хирургии сердца при экстракорпоральном кровоснабжении, и нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз (ALS) (см. примеры 7 и 8 ниже).
Под "антисудорожной активностью" имеют в виду эффективность в уменьшении судорог, вызываемых такими состояниями, как простой парциальный эпилептический припадок, сложный парциальный эпилептический припадок, эпилептический статус и индуцируемый травмой эпилептический припадок, такой как встречающийся после повреждения головы, в том числе при хирургии головы (см. примеры 9 и 10 ниже).
Под "анксиолитической" активностью имеют в виду, что соединение уменьшает чувство страха, неопределенности и тревоги, которые характерны для состояния тревоги.
Под аналгезирующей активностью (болеутоляющей)" имеют в виду, что соединение вызывает отсутствие боли в ответ на стимул, который в норме был бы болезненным. Такая активность могла бы использоваться в клинических состояниях, таких как острая и хроническая боль, в том числе, но не только, для преразгрузочной предоперативной аналгезии; для периферических невропатий, встречающихся при сахарном диабете и множественном склерозе; фантомной боли; каузалгии; невралгиях, таких, которые встречаются при простом герпесе; боли, такой, которая наблюдается при повреждениях спинного мозга; гипералгезии и аллодинии.
Под "каузалгией" имеют в виду болезненное нарушение, связанное с повреждением периферических нервов.
Под "невралгией" имеют в виду боль в расположении нерва или нервов.
Под "гипералгезией" подразумевают повышенный ответ на стимул, который является в норме болезненным.
Под "аллодинией" имеют в виду боль, вызываемую стимулом, который в норме не вызывает боли (см. пример 11 - пример 14 ниже).
Под "индукцией долгосрочного потенциирования в срезах гиппокампа" имеют в виду способность вызывающей судороги электрической стимуляции афферентных коллатеральных волокон Шаффера для индуцирования долгосрочных увеличений в силе синаптической трансмиссии (передаче нервного импульса) в пути коллатеральных-СА1 пирамидальных нейронов Шаффера в срезах гиппокампа крысы, сохраняемых in vitro (см. пример 19).
Под "терапевтической дозой" имеют в виду количество соединения, которое облегчает до некоторой степени один или несколько симптомов заболевания или состояния пациента. Кроме того, под "терапевтической дозой" подразумевают количество, которое возвращает к нормальным, частично или полностью, физиологические или биохимические параметры, связанные с заболеванием или состоянием или являющиеся причинами заболевания или состояния. Как правило, это количество между 1 нмоль и 3 нмоль соединения, в зависимости от его EC50 (IC50 в случае антагониста) и от возраста, размера и заболевания, связанного с пациентом.
Под "повреждением познавательной способности" имеют в виду способность ухудшения восприимчивости памяти или выполнения выученного задания (см. пример 20). Под "повреждением познавательной способности" подразумевают способность противодействовать нормальным процессам рационального мышления и обоснования.
Под "нарушением двигательной функции" имеют в виду способность значительно изменять опорно-двигательную активность (см. пример 15) или вызывать значительную атаксию, потерю установочного рефлекса, седативный эффект или мышечную релаксацию (см. пример 16).
Под "опорно-двигательной активностью" подразумевают способность выполнять нормальные амбулаторные движения.
Под "потерей установочного рефлекса" подразумевают способность животного, обычно грызуна, самостоятельно выпрямляться после помещения его в супинированное положение.
Под "вакуолизацией нейронов" подразумевают образование вакуолей в нейронах поясного или ретросплениального кортекса (см. пример 16).
Под "сердечно-сосудистой активностью" имеют в виду способность вызывать значимые изменения в параметрах, включающих в себя (но не только) среднее артериальное кровяное давление и частоту сердечных сокращений (см. примеры 21 и 22).
Под "повышенной возбудимостью" подразумевают повышенную чувствительность к возбуждающему стимулу. Повышенная возбудимость часто проявляется как значительное увеличение в опорно-двигательной активности у грызунов, которым введено лекарственное средство (см. пример 15).
Под "седативным эффектом" подразумевают успокаивающий эффект или ослабление активности и возбуждения. Седативный эффект часто проявляется как значительное уменьшение опорно-двигательной активности у грызунов, которым введено лекарственное средство (см. пример 15).
Под "РСР-подобным потенциалом злоупотребления (токсикомании)" подразумевают потенциал лекарственного средства быть неправильно употребляемым, как в случае рекреационного использования РСР (т.е. "ангельского порошка") людьми. Считают, что РСР-подобный потенциал злоупотребления может быть предсказан по способности лекарственного средства обобщаться с РСР в грызунах, приученных к отличению РСР от солевого раствора (см. пример 17).
Под "обобщением с РСР" подразумевают, что соединение воспринимается как РСР в грызунах, обученных отличать РСР от солевого раствора (см. пример 17).
Под "РСР-подобной психотомиметической активностью" подразумевают способность лекарственного средства вызывать у людей поведенческий синдром, напоминающий острый психоз, включающий в себя галлюцинации, паранойю, ажитацию и дезориентацию во времени и пространстве (спутанность сознания). Считают, что РСР-подобная психотомиметическая активность может быть предсказана у грызунов по способности лекарственного средства вызывать РСР-подобные стереотипии, в том числе атаксию, верчение головой из стороны в сторону, повышенную возбудимость и обобщение с РСР у грызунов, обученных отличать РСР от солевого раствора (см. пример 16 и пример 17).
Под "атаксией" подразумевают недостаточность в мышечной координации.
Под "верчением головой" подразумевают стереотипическое поведение, вызываемое у грызунов РСР, при котором голова периодически движется медленно и широко от одной стороны к другой.
Под "фармацевтической композицией" имеют в виду терапевтически эффективное количество соединения данного изобретения в фармацевтически приемлемом носителе, т.е. препарат, к которому может быть добавлено соединение для растворения или облегчения другим образом введения этого соединения. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают воду, солевой раствор и физиологически забуференный солевой раствор. Такую фармацевтическую композицию обеспечивают в подходящей дозе. Такими композициями являются в общем композиции, которые одобряются для использования в лечении описываемого нарушения FDA или соответствующей организацией в других странах.
В родственном аспекте данное изобретение относится к способу лечения неврологического заболевания или нарушения, включающему стадию введения фармацевтической композиции, содержащей соединение, которое связывается с оперируемым рецептором кальциевым каналом при сайте, связанном одним из арилалкиламинов (соединением 1, соединением 2 и соединением 3), причем это соединение является сильнодействующим и селективным неконкурентным антагонистом при таком оперируемом рецептором кальциевом канале и имеющим одно или несколько следующих фармакологических и физиологических свойств: эффективность в биохимических и электрофизиологических тестах in vitro функции оперируемого рецептором кальциевого канала, противосудорожную активность in vivo, нейропротекторную активность in vivo, транквилизирующую активность in vivo и аналгезирующую активность in vivo; указанное соединение обладает также одним или несколькими из следующих фармакологических свойств: соединение не препятствует индукции долгосрочного потенциирования в срезах гиппокампа крыс и при терапевтической дозе не ухудшает познавательную способность, не нарушает двигательную функцию, не вызывает вакуолизации нейронов, имеет минимальную сердечно-сосудистую активность, не производит седативного эффекта или повышенной возбудимости, имеет минимальный РСР-подобный потенциал злоупотребления и имеет минимальную РСР-подобную психотомиметическую активность. Под "минимальным" имеют в виду, что любое побочное действие этого лекарственного средства переносится средним индивидуумом и, следовательно, что лекарственное средство может быть использовано для терапии заболевания-мишени. Такие побочные действия хорошо известны в данной области и рутинно рассматриваются FDA как минимальные при одобрении лекарственного средства для заболевания-мишени.
Лечение включает в себя стадии идентификации сначала пациента, который страдает от неврологического заболевания или нарушения, стандартной клинической методологией и затем лечение такого пациента композицией данного изобретения.
В следующем аспекте данное изобретение относится к соединениям, которые могут использоваться для лечения пациента, имеющего неврологическое заболевание или нарушение, причем соединение является соединением типа полиамина или его аналога (т.е. полигетероатомной молекулой), имеющим формулу
где Аr обозначает подходящим образом замещенное ароматическое кольцо, циклическую систему или другую гидрофобную часть молекулы; Аг может быть ароматическим (например, карбоциклическими арильными группами, такими как фенил, или бициклическими карбоциклическими арильными циклическими системами, такими как нафтил, 1,2,3,4-тетрагидронафтил, инданил и инденил), гетероароматическими (например, индолилом, дигидроиндолилом, хинолинилом и изохинолинилом и их соответствующими 1,2,3,4-тетрагидро- и 2-оксопроизводными), алициклическими (циклоалифатическими) или гетероалициклическими кольцом или циклической структурой (моно-, би- или трициклической структурой), имеющими 5-7-членное (членные) кольцо (кольца), необязательно замещенные 1-5 заместителями, независимо выбранными из низшего алкила с 1-5 атомами углерода, низшего галогеналкила из 1-5 атомов углерода, замещенного 1-7 атомами галогена, низшего алкокси из 1-5 атомов углерода, галогена, нитро, амино, низшего алкиламино из 1-5 атомов углерода, амидо, низшего алкиламидо из 1-5 атомов углерода, циано, гидроксила, сульфгидрила, низшего ацила из 2-4 атомов углерода, сульфонамидо, низшего алкилсульфонамидо из 1-5 атомов углерода, низшего алкилсульфоксида из 1-5 атомов углерода, низшего гидроксиалкила из 1-5 атомов углерода, низшего алкилкето из 1-5 атомов углерода или низшего тиоалкила из 1-5 атомов углерода;
каждый m равен целому числу от 0 до 3 включительно,
каждый k равен целому числу от 1 до 10 включительно,
каждый j, одинаковые или различные, обозначает целое число от 1 до 12 включительно,
каждый R1 и R2 независимо выбран из группы, включающей водород, низший алкил из 1-5 атомов углерода, низший алкиламино из 1-5 атомов углерода, низший алкиламидо из 1-5 атомов углерода, низший моно-, ди- или трифторалкил из 1-5 атомов углерода, гидрокси, амидино, гуанидино или боковую цепь типичной обычной аминокислоты, или со связанным атомом углерода R1 и R2 , взятые вместе, образуют карбонил, и каждый Z выбран из группы, включающей азот, кислород, серу, амидо, сульфонамидо и углерод.
Предпочтительные ароматические головные группы включают (но не ограничены ими) следующее:
где Y =
Из данного изобретения исключены известные соединения, химические структуры которых охватываются общей формулой, представленной выше.
В дальнейших предпочтительных вариантах соединение выбрано из группы Соединений 4-18, где эти соединения имеют формулы:
Заявитель определил также (см. пример 23 ниже), что упрощенные арилалкиламины (см. ниже) являются сильнодействующими, неконкурентными антагонистами комплекса NMDA-рецептор-ионофор. Упрощенные арилалкиламины отличаются от арилалкил-аминов, представленных соединениями 4-18, описанными выше. Например, такие соединения связываются с сайтом, меченным [3H]MK-801, при концентрациях, приблизительно в 1-400 раз более высоких, чем концентрации, которые противодействуют опосредованной NMDA-рецептором функции. Такие упрощенные арилалкиламины обладают одним или несколькими следующими дополнительными свойствами: значительной нейропротекторной активностью, значительной противосудорожной активностью, значительной аналгезирующей активностью, отсутствием РСР-подобного стереотипического поведения у грызунов (повышенной возбудимости и верчения головой) при эффективных нейропротекторных, противосудорожных и аналгезирующих дозах, отсутствием обобщения с РСР в тесте дискриминации РСР при эффективных нейропротекторных, противосудорожных и аналгезирующих дозах, отсутствием вакуолизации нейронов при эффективных нейропротекторных, противосудорожных и аналгезирующих дозах, значительно менее сильной активностью против потенциал-зависимых кальциевых каналов и минимальной гипотензивной активностью при эффективных нейропротекторных, противосудорожных и аналгезирующих дозах. Однако такие соединения могут ингибировать индукцию LTP в срезах гиппокама крыс и могут вызывать ухудшение двигательной способности при нейропротекторных, противосудорожных и аналгезирующих дозах.
Один аспект данного изобретения относится к способу лечения пациента, имеющего неврологическое заболевание или нарушение, предусматривающему введение соединения формулы I:
где
R1 и R5 независимо выбраны из группы, включающей фенил, бензил и фенокси (каждый из которых необязательно замещен (X)m), -Н, алкил, гидроксиалкил, -ОН, -O-алкил и -O-ацил;
R2 и R6 независимо выбраны из группы, включающей -Н, алкил и гидроксиалкил; или R2 и R6 вместе представляют собой имино; или R1 и R2 вместе представляют собой -(СН 2)n- или -(CH2)n-N(R 3)-(CH2)n-;
R3 независимо выбран из группы, включающей –Н, алкил, 2-гидроксиэтил и алкилфенил; n равно целому числу от 0 до 6, но только 1 n может быть 0;
R4 выбран из группы, включающей тиофуран, пиридил, фенил, бензил, фенокси и фенилтио (каждый из которых необязательно замещен (Х)m), -Н, алкил и циклоалкил;
Х независимо выбран из группы, включающей фенил, бензил и фенокси (каждый из которых необязательно замещен (X)m ), -Н, -Br, -Cl, -I, -F, -СF3, алкил, -ОН, -ОСF 3, -O-алкил и -O-ацил;
m независимо равно целому числу от 0 до 5;
Y обозначает –NR3R3 , за исключением того, что, когда R1 и R2 вместе обозначают - (СН2)n-N(R3 )-(СН2)n-, тогда Y обозначает -Н;
и его фармацевтически приемлемых солей и комплексов, при этом соединение является активным при NMDA-рецепторе.
Под "пациентом" подразумевают любое животное, имеющее клетку с NMDA-рецептором. Предпочтительно это животное является млекопитающим. Наиболее предпочтительно оно является человеком.
Под "алкилом" имеют в виду разветвленную или неразветвленную углеводородную цепь, содержащую 1-6, предпочтительно 1-4, атомов углерода, например метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, 2-метилпентил, циклопропилметил, аллил и циклобутилметил.
Под "низшим алкилом" имеют в виду разветвленную или неразветвленную углеводородную цепь, содержащую 1-4 атома углерода, примеры которой перечислены здесь.
Под "гидроксиалкилом" имеют в виду алкильную группу, описанную выше, замещенную гидроксильной группой.
Под "алкилфенилом" имеют в виду алкильную группу, описанную выше, замещенную фенильной группой.
Под "ацилом" имеют в виду -C(O)R, где R является Н или алкилом, определенным выше, например формил, ацетил, пропионил или бутирил;
или R обозначает -O-алкил, такой как в алкилкарбонатах, или R обозначает N-алкил, такой как в алкилкарбаматах.
Под "циклоалкилом" имеют в виду разветвленную или неразветвленную циклическую углеводородную цепь, содержащую 3-12 атомов углерода.
В предпочтительных аспектах данного изобретения
Y выбран из группы, включающей –NH2 и -NH-метил;
R4 представляет собой тиофуран, пиридил, фенил, бензил, фенокси или фенилтио, каждый из которых необязательно замещен (Х)m;
(Х)m независимо выбран из группы, включающей мета-фтор, мета-хлор, орто-O-низший алкил, орто-метил, орто-фтор, орто-хлор, мета-O-низший алкил, мета-метил, орто-ОН и мета-ОН; и
R1, R2, R 5 и R6 обозначают -Н; или R2 обозначает метил, и R1, R5 и R6 обозначают -Н; или R1 обозначает метил и R2, R 5 и R6 обозначают -Н.
В других предпочтительных аспектах данного изобретения R1 и R5 независимо выбраны из группы, включающей -Н, низший алкил, гидроксиалкил, -ОН, -O-алкил и -O-ацил;
R2 и R6 независимо выбраны из группы, включающей –Н, низший алкил и гидроксиалкил;
или R1 и R2 вместе обозначают -(СН 2)n- или - (CH2)n -N(R3)- и Y обозначает -Н;
R3 независимо выбран из группы, включающей –Н и низший алкил;
n равно целому числу от 1 до 6;
R4 выбран из группы, включающей тиофуран, пиридил, фенил, бензил, фенокси и фенилтио (каждый из которых необязательно замещен (Х)m), -Н, низший алкил и циклоалкил;
Х независимо выбран из группы, включающей –Н, -Br, -Cl, -F, -I, -СF3, низший алкил, -ОН и –ОСF3;
m независимо равно целому числу от 0 до 5;
Y обозначает -NHR3 или водород, когда R1 и R2 вместе представляют собой -(CH 2)n-N(R3)-;
и их фармацевтически приемлемые соли и комплексы, при условии, что
(a) когда R1 и R2 вместе обозначают - (CH2 )n-N(R3)-, тогда R5, R6 и Y обозначают водород; и
(b) когда R1 и R2 вместе не обозначают - (CH2) n-N(R3)-, тогда Y обозначает -NHR3 .
В следующем предпочтительном аспекте данное изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего неврологическое заболевание или нарушение, предусматривающий введение соединений формулы II:
где X независимо выбран из группы, включающей -Н, -Br, -Cl, -F, -I, -СF3, алкил, -ОН, -ОСF3, -O-алкил и -O-ацил; R1 независимо выбран из группы, включающей -Н, алкил, гидроксиалкил, -ОН, -O-алкил и -O-ацил; R2 независимо выбран из группы, включающей -Н, алкил и гидроксиалкил, или оба R2 вместе обозначают имино; R3 независимо выбран из группы, включающей -Н, алкил, 2-гидроксиэтил и алкилфенил; и m независимо равно целому числу от 0 до 5; или соединений формулы III:
где Х независимо выбран из группы, включающей -Н, -Br, -C1, -F, -I, -СF3, алкил, -ОН, -ОСF3, -O-алкил и -O-ацил; R1 независимо выбран из группы, включающей -Н, алкил, гидроксиалкил, -ОН, -O-алкил и -O-ацил; R2 независимо выбран из группы, включающей –Н, алкил и гидроксиалкил, или оба R2 вместе обозначают имино; R3 независимо выбран из группы, включающей -Н, алкил, 2-гидроксиэтил и алкилфенил; R4 выбран из группы, включающей тиофуран, пиридил, фенил, бензил, фенокси и фенилтио (каждый из которых необязательно замещен (Х)m), алкил и циклоалкил; и m независимо равно целому числу от 0 до 5; или соединений формул IV и V.
где n равно целому числу от 1 до 6; Х независимо выбран из группы, включающей –Н, -Br, -Cl, -F, -I, -СF3, алкил, -ОН, -ОСF3, -O-алкил и -O-ацил; R1 независимо выбран из группы, включающей –Н, алкил, 2-гидроксиэтил и алкилфенил; и m независимо равно целому числу от 0 до 5; или соединений формул VI и VII:
где n равно целому числу от 1 до 6; Х независимо выбран из группы, включающей -Н, -Br, -Cl, -F, -I, -СF3, алкил, -ОН, -ОСF3, -O-алкил и -O-ацил; R3 независимо выбран из группы, включающей –Н, алкил, 2-гидроксиэтил и алкилфенил; R4 выбран из группы, включающей тиофуран, пиридил, фенил, бензил, фенокси и фенилтио (каждый из которых необязательно замещен (Х)m), алкил и циклоалкил; и m независимо равно целому числу от 0 до 5.
Более предпочтительные аспекты являются вариантами, в которых (Х)m независимо выбран из группы, включающей мета-фтор, мета-хлор, орто-O-низший алкил, орто-метил, орто-фтор, орто-хлор, мета-O-низший алкил, мета-метил, орто-ОН и мета-ОН; NR3 выбран из группы, включающей NH, N-метил и N-этил; NR3R3 выбран из группы, включающей NH2, NH-метил и NH-этил; каждый R1 независимо выбран из группы, включающей -Н и метил; каждый R2 выбран из группы, включающей -Н и метил; и R4 выбран из группы, включающей фенил, бензил и фенокси, каждый из которых необязательно замещен (Х) m.
Особенно предпочтительными аспектами являются варианты, в которых (Х)m обозначает мета-фтор; NR 3 выбран из группы, включающей NH и N-метил; и NR3 R3 выбран из группы, включающей NH2 и NH-метил, каждый из R1 и R2 обозначает -Н; и R4 выбран из группы, включающей фенил, бензил и фенокси, каждый из которых необязательно замещен (Х)m .
В предпочтительных вариантах способы лечения включают введение соединения, выбранного из Соединений 19-150 или их фармацевтически приемлемых солей и комплексов. Предпочтительно это соединение имеет IС50 10 мкМ при NMDA-рецепторе, более предпочтительно 2,5 мкМ и наиболее предпочтительно 0,5 мкМ при NMDA-рецепторе.
В следующих предпочтительных вариантах способы лечения включают введение соединения с IC 50 10 мкМ при NMDA-рецепторе, выбранного из группы, включающей соединения 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 139, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 и 150 и их фармацевтически приемлемых солей и комплексов.
В более предпочтительных вариантах способы лечения включают введение соединения с IC50 2,5 мкМ при NMDA-рецепторе, выбранного из группы, включающей соединения 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 100, 101, 102, 103, 105, 106, 108, 109, 111, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 139, 142, 144, 145, 146, 147, 148, 149 и 150 и их фармацевтически приемлемых солей и комплексов. В других вариантах соединение выбрано из группы, включающей соединения 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 76, 82, 83, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 101, 102, 103, 105, 109, 111, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 135, 136, 137, 138, 139, 142, 144, 145, 148, 149 и 150 и их фармацевтически приемлемых солей и комплексов.
В особенно предпочтительных вариантах способы лечения включают введение соединения с IC50 0,5 мкМ при NMDA-рецепторе, выбранного из группы, включающей соединения 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 38, 39, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 82, 83, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 96, 97, 103, 111, 118, 119, 120, 122, 126, 135, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 142, 144, 145, 147, 148, 149 и 150 и их фармацевтически приемлемых солей и комплексов.
В более предпочтительных вариантах способы лечения включают введение соединения, выбранного из группы, включающей соединения 20, 24, 25, 33, 50, 60, 66, 69, 103, 111, 118, 119, 120, 122, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 142, 144, 145, 148, 149 и 150 и их фармацевтически приемлемых солей и комплексов.
В особенно предпочтительных вариантах способы лечения включают введение соединения, выбранного из группы, включающей соединения 20, 33, 50, 60, 119 и 144 и их фармацевтически приемлемых солей и комплексов.
В других особенно предпочтительных вариантах способы лечения включают введение соединения, выбранного из группы, включающей соединения 33, 50, 60, 119 и 144 и их фармацевтически приемлемых солей и комплексов.
Данное изобретение обеспечивает упрощенные арилалкиламины, включающие соединения формул I-VII и все предпочтительные аспекты формул I-VII, описанные выше.
Примеры таких упрощенных арилалкиламинов включают, но не ограничены ими, соединения 19-150, структуры которых даны выше. Предпочтительно соединение имеет IC50 10 мкМ при NMDA-рецепторе. Более предпочтительно соединение имеет IC50 5 мкМ, более предпочтительно 2,5 мкМ и наиболее предпочтительно 0,5 мкМ при NMDA-рецепторе.
В предпочтительных вариантах соединение имеет IC50 10 мкМ при NMDA-рецепторе и выбрано из группы, включающей соединения 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 76, 78, 79, 82, 83, 84, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 101, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 111, 115, 116, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 134, 135, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 139, 141, 142, 143, 144, 145, 148, 149 и 150. В других вариантах соединение выбрано из группы, включающей соединения 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 76, 82, 83, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 101, 102, 103, 105, 109, 111, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 135, 136, 137, 138, 139, 142, 144, 145, 148, 149 и 150.
В более предпочтительных вариантах соединение имеет IC50 2,5 мкМ при NMDA-рецепторе и выбрано из группы, включающей соединения 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 76, 82, 83, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 101, 102, 103, 105, 108, 109, 111, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 135, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 139, 142, 144, 145, 148, 149 и 150.
В особенно предпочтительных вариантах соединение имеет IC50 0,5 мкМ при NMDA-рецепторе и выбрано из группы, включающей соединения 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 33, 38, 39, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 82, 83, 89, 90, 93, 94, 95, 96, 103, 111, 118, 119, 120, 122, 126, 135, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 142, 144, 145, 148, 149 и 150.
В предпочтительных вариантах соединение выбрано из группы, включающей соединения 24, 25, 33, 50, 60, 66, 69, 103, 111, 118, 119, 120, 122, 136, 137, 138, 142, 144, 145, 148, 149 и 150.
В особенно предпочтительных вариантах соединение выбрано из группы, включающей соединения 20, 33, 50, 60, 119 и 144.
В еще более предпочтительных вариантах соединение выбрано из группы, включающей соединения 33, 50, 60, 119 и 144.
Из состава данного аспекта изобретения исключены известные соединения, химические структуры которых охватываются общими формулами, представленными выше.
В аспекте данного изобретения обеспечены также фармацевтические композиции, применимые для лечения пациента, имеющего неврологическое заболевание или нарушение. Эти фармацевтические композиции обеспечены в фармацевтически приемлемом носителе и в подходящей дозе. Фармацевтические композиции могут быть в форме фармацевтически приемлемых солей и комплексов, как это известно специалистам в данной области.
Фармацевтические композиции содержат соединения формул I-VII и включают все предпочтительные аспекты формул I-VII, описанные выше.
Предпочтительные фармацевтические композиции содержат соединения 19-150. Предпочтительно соединение имеет IC50 10 мкМ при NMDA-рецепторе. Более предпочтительно соединение имеет IC50 5 мкМ, еще более предпочтительно 2,5 мкМ и наиболее предпочтительно 0,5 мкМ при NMDA-рецепторе.
В следующих предпочтительных вариантах фармацевтическая композиция содержит соединение с IC 50 10 мкМ при NMDA-рецепторе, выбранное из группы, включающей соединения 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 139, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 и 150. Предпочтительно соединение выбрано из группы, включающей соединения 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 33, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 76, 78, 79, 82, 83, 84, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 101, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 111, 115, 116, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 134, 135, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 139, 141, 142, 143, 144, 145, 148, 149 и 150.
В других вариантах соединение выбрано из группы, включающей соединения 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 76, 82, 83, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 101, 102, 103, 105, 109, 111, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 135, 136, 137, 138, 139, 142, 144, 145, 148, 149 и 150.
В более предпочтительных вариантах фармацевтическая композиция содержит соединение с IC 50 2,5 мкМ при NMDA-рецепторе, выбранное из группы, включающей соединения 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 100, 101, 102, 103, 105, 106, 108, 109, 111, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 139, 142, 144, 145, 146, 148, 149 и 150. Предпочтительно соединение выбрано из группы, включающей соединения 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 76, 82, 83, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 101, 102, 103, 105, 108, 109, 111, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 135, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 139, 142, 144, 145, 148, 149 и 150.
В особенно предпочтительных вариантах, фармацевтическая композиция содержит соединение с IС50 0,5 мкМ при NMDA-рецепторе, выбранное из группы, включающей соединения 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 38, 39, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 82, 83, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 96, 97, 103, 111, 118, 119, 120, 122, 126, 135, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 142, 144, 145, 148, 149 и 150. Предпочтительно соединение выбрано из группы, включающей соединения 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 33, 38, 39, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 82, 83, 89, 90, 93, 94, 95, 96, 103, 111, 118, 119, 120, 122, 126, 135, 136, 137, 138 (потенциальное пролекарство), 142, 144, 145, 148, 149 и 150.
В более предпочтительных вариантах фармацевтическая композиция содержит соединение, выбранное из группы, включающей соединения 20, 24, 25, 33, 50, 60, 66, 69, 103, 111, 118, 119, 120, 122, 136, 137, 138, 142, 144, 145, 148, 149 и 150. Предпочтительно соединение выбрано из группы, включающей соединения 24, 25, 33, 50, 60, 66, 69, 103, 111, 118, 119, 120, 122, 136, 137, 138, 142, 144, 145, 148, 149 и 150.
В наиболее предпочтительных вариантах фармацевтическая композиция содержит соединение, выбранное из группы, включающей соединения 20, 33, 50, 60, 119 и 144.
Предпочтительно соединение выбрано из группы, состоящей из соединения 33, 50, 60, 119 и 144.
В случае таких соединений, как 20 или 60, могут быть произведены структурные модификации, которые не изменяют существенно иллюстрируемое здесь соотношение структуры-активности (SAR). Например, могут быть выполнены успешная биоизостерическая замена или замещение необязательно замещенных фенильных групп, таких, какие встречаются в соединениях 20 или 60, другими липофильными или полуполярными ароматическими (например, нафтилом, нафтокси, бензилом, фенокси, фенилтио), алифатическими (алкилом, например изопропилом), циклоалифатическими (циклоалкилом, например циклогексилом), гетероциклическими [например, пиридилом, фуранилом, тиофуранилом (тиофенилом)] или другими функциональными группами или системами, как это хорошо известно в данной области, которые дадут клинически применимые соединения (структурные гомологи, аналоги и/или близкие по природе соединения) со сходными биофармацевтическими свойствами и активностью при NMDA-рецепторе (например, сравните соединения 37, 75, 79, 83, 89, 119-122, 125, 126, 128, 130, 132, 137, 144 и 145). Например, такие замены или замещения использовали с большим успехом в разработке SAR среди других групп очень клинически и коммерчески успешных синтетических фармацевтических средств, таких как классические H1-антигистаминные средства, антихолинергические средства (антимускариновые средства; например средства против болезни Паркинсона), антидепрессанты (в том числе трициклические соединения) и опиоидные аналгезирующие средства (См. Foye et al. (Eds.) Principles of Medicinal Chemistry, 4th ed., Lea and Febiger/Williams and Wilkins, Philadelphia, PA, 1995, pp.233, 265, 281-282, 340-341, 418-427 и 430; Prous, J.R., The Year's Drug News, Therapeutic Targets - 1995 Edition, Prous Science Publishers, Barcelona, Spain, 1995, pp.13, 55-56, 58-59, 74, 89, 144-145, 152, 296-297 и 317). Также биоизостерическая замена или замещение метиленовых или метиновых групп в пропильном каркасе таких соединений, как 20 или 60, например кислородом, серой или азотом, будет давать клинически применимые активные в отношении NMDA-рецептора соединения с применимыми подобным образом биофармацевтическими свойствами, такие как 88 (модифицированная структура "классического H1-антигистаминного типа"), которая может быть оптимизирована далее для приобретения активности при NMDA-рецепторе получением, например, соответствующего соединения (соединений), содержащих, например, (бис)-(3-фторфенил)-группу (группы), как описано в данном изобретении. Пропильная структура соединений, таких как 20 и 60, также может быть успешно модифицирована включением циклических систем (как в соединениях 102 и 111) и/или ненасыщенностью (например, двойной связью, как в соединениях 81, 106, 109 и 139) с получением дополнительных клинически применимых NMDA-рецептор-активных соединений данного изобретения (сравните соединения, цитированные выше).
В родственном аспекте данное изобретение относится к способу получения терапевтического агента, предусматривающему стадии скрининга на такой агент путем определения, является ли этот агент активным на оперируемом рецептором кальциевом канале, и синтеза этого терапевтического агента в количестве, достаточном для обеспечения его в терапевтически эффективном количестве для пациента. Такие скрининги могут быть выполнены способами, известными специалистам с обычной квалификацией в данной области, и могут быть, например, выполнены способами, изложенными здесь. Специалисты в данной области знакомы также со способами, применяемыми для синтеза терапевтических средств в количествах, достаточных для терапевтических целей.
В предпочтительном варианте оперируемый рецептором кальциевый канал представляет собой NMDA-рецептор. В более предпочтительном аспекте указанный выше способ включает стадию добавления фармацевтически приемлемого носителя к указанному агенту. В следующем предпочтительном аспекте (варианте) указанный терапевтический агент включает соединение формулы I, представленной здесь. Еще в одном предпочтительном аспекте (варианте) этот терапевтический агент включает соединение Формул II, III, IV, V, VI или VII, представленных здесь. В особенно предпочтительных аспектах терапевтический агент включает соединение, имеющее структуру, выбранную из группы, включающей Формулы I-VII, и все предпочтительные аспекты этих формул, описанные здесь. В дальнейших предпочтительных вариантах терапевтический агент выбран из группы, включающей соединения 19-150. В особенно предпочтительном аспекте, указанный терапевтический агент используют для лечения пациента, имеющего неврологическое заболевание или нарушение. В родственном аспекте указанный скрининг включает стадию идентификации соединения, которое связывается с оперируемым рецептором кальциевым каналом при сайте, связанном одним из арилалкиламинов, соединением 1, соединением 2 и соединением 3.
Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидны из следующего далее описания его предпочтительных вариантов и из формулы изобретения.
Описание предпочтительных вариантов
Далее следует подробное описание способов и тестов, при помощи которых терапевтически ценные соединения могут идентифицироваться и использоваться для лечения неврологических нарушений и заболеваний. В тестах в качестве примера используют соединение 1, соединение 2 или соединение 3, но другие соединения, имеющие сходную биологическую активность в этих тестах, также могут быть использованы (как это обнаружено) для улучшения тестов. Основные соединения, такие как соединение 1, соединение 2 или соединение 3, могут быть использованы для молекулярного моделирования с применением стандартных процедур, или существование новых соединений в библиотеках природных продуктов может подвергаться скринингу согласно описанным ниже способам.
Один ключевой способ является средством, при помощи которого соединения могут быть подвергнуты быстрому скринингу стандартными способами связывания радиолиганда (тест связывания радиоактивно меченного арилалкиламина) для идентификации соединений, которые связываются при том же сайте на оперируемых рецептором Са 2+-каналах, что и соединение 1, соединение 2 или соединение 3. Данные из таких исследований связывания радиолиганда также будут подтверждать, что указанные соединения не ингибируют связывание [3H]-арилалкиламина через действие при известных сайтах на оперируемых рецептором Са2+-каналах (таких как глутамат связывающий сайт, глицинсвязывающий сайт, МК-801-связывающий сайт, Zn2+-связывающий сайт, Мg2+-связывающий сайт, сигма-связывающий сайт или полиаминсвязывающий сайт на комплексе NMDA-рецептор-ионофор). Этот тест-скрининг позволит идентифицировать многочисленные количества потенциально применимых соединений и подвергнуть их скринингу на активность в других тестах. Специалистам в данной области будет понятно, что могут быть придуманы другие быстрые тесты для обнаружения связывания с сайтом арилалкиламинов на оперируемых рецептором Са2+ -каналов и использованы в данном изобретении.
Дополнительное тестирование использует электрофизиологическую (patch сlamp- пэтч-кламп") методологию для расширения результатов, полученных при помощи вышеупомянутого теста связывания радиолиганда. Такие результаты будут подтверждать, что соединения, связывающиеся с сайтом арилалкиламинов, являются функциональными, неконкурентными антагонистами оперируемых рецепторами Са2+-каналов со следующими свойствами, общими с самими арилалкиламинами: ингибированием открытого канала, проявляющимся как зависимое от использования ингибирование, и потенциал-зависимым появлением и обращением ингибирования. Такие результаты будут также подтверждать, что эти соединения не имеют их первичной активности при описанных ранее сайтах на оперируемых рецептором Са2+-каналах (таких как глутаматсвязывающий сайт, глицинсвязывающий сайт, МК-801-связывающий сайт, Zn2+-связывающий сайт, Мg 2+-связывающий сайт, сигма-связывающий сайт или полиаминсвязывающий сайт на комплексе NMDA-рецептор-ионофор).
Кроме того, может быть использована технология рекомбинантных ДНК, используемая для того, чтобы сделать такое тестирование даже еще более быстрым. Например, при помощи стандартных процедур могут быть идентифицированы и клонированы ген (гены), кодирующие новый арилалкиламинсвязывающий сайт (т.е. рецептор). Это может быть выполнено одним из нескольких путей. Например, можно приготовить аффинную арилалкиламиновую колонку и пропускать соллюбилизированные мембраны из клеток или тканей через эту колонку. Рецепторные молекулы связываются с колонкой и, следовательно, их можно выделить. Затем можно получить информацию о частичной аминокислотной последовательности, которая позволяет выделить ген, кодирующий рецептор. Альтернативно получают экспрессионные библиотеки кДНК и субфракции этой библиотеки тестируют на их способность наделять арилалкиламиновыми рецепторами клетки, которые обычно не экспрессировали такие рецепторы (например, клетки СНО, мышиные L-клетки, клетки НЕК 293 или ооциты Xenopus). Таким путем идентифицируют фракцию библиотеки, содержащую клон, кодирующий рецептор. Последовательное субфракционирование активных фракций библиотеки и тестирование в конце концов приводят к одному клону, кодирующему рецептор арилалкиламина. Подобным образом, может быть использовано hybrid-arrest (с задержкой гибрида) и hybrid-depletion (с истощением гибрида) клонирование. Ооциты Xenopus инъецировали мРНК из подходящего источника ткани или клеток (например, из ткани мозга человека). Экспрессию рецептора арилалкиламина детектировали, например, как стимулируемый NMDA или глутаматом приток кальция, который может быть блокирован соединением 1, соединением 2 или соединением 3. Клоны кДНК тестировали на их способность ингибировать экспрессию этого рецептора при гибридизации кДНК или кРНК с выбранной мРНК, перед инъекцией в ооциты Xenopus. Затем клон, ответственный за это действие, выделяли согласно описанному выше способу. После выделения гена рецептора использовали стандартные способы для идентификации полипептида или его части (частей), которая (которые) достаточны для связывания арилалкиламинов (арилалкиламин связывающего домена (доменов)). Далее при помощи стандартных процедур весь рецептор или арилалкиламинсвязывающий домен (домены) можно экспрессировать рекомбинантной технологией. Рецептор или связывающий домен (домены) могут быть выделены и использованы в качестве биохимического реагента таким образом, что скорее может быть использован простой тест прямого связывания, чем конкурентный анализ, описанный ниже. То есть скрининг проводят на соединения, которые связываются при новом рецепторе арилалкил-амина. Таким путем можно скринировать одновременно большие количества соединений, например, проведением через колонку, содержащую новый рецептор арилалкиламинов или домен связывания арилалкиламинов, и анализ выполняют на соединениях, которые связываются с этой колонкой.
Дополнительное тестирование использует сочетание молекулярно-биологических способов (экспрессию клонированных рецепторов NMDA, АМРА или никотиновых холинергических рецепторов) и электрофизиологических (patch clamps="пэтч-кламп") способов. Конкретно аналоги арилалкиламина могут быть подвергнуты быстрому скринингу на их действие при клонированных и экспрессированных субъединицах вышеупомянутых комплексов рецептор-ионофор. Для идентификации, какие аминокислотные остатки могут быть важными в определении силы действия арилалкиламина, можно использовать сайт-направленный мутагенез.
Тесты на сильнодействующие и селективные антагонисты оперируемых рецепторами кальциевых каналов в ЦНС млекопитающих
Желательные свойства лекарственного средства включают высокую аффинность и селективность в отношении оперируемых рецепторами Са2+-каналов, таких, какие присутствуют в комплексах NMDA-, АМРА- и никотиновый холинергический рецептор-ионофор (по сравнению с ответами, медиируемыми через другие нейротрансмиттерные рецепторы, оперируемые нейротрансмиттерами ионные каналы или потенциал-зависимые ионные каналы), и неконкурентный антагонизм оперируемых рецепторами Са2+-каналов.
Комплекс NMDA-рецептор-ионофор используют в качестве примера оперируемого рецептором Са2+-канала. Активация рецептора NMDA открывает катион-избирательный канал, что делает возможным приток внеклеточных Са2+ и Na+ и приводит к увеличению [Са2+]i и деполяризации клеточной мембраны. Измерения [Са2+]i использовали в качестве первичных тестов для детектирования активности арилалкиламиновых соединений на рецепторах NMDA. Очищенные арилалкиламины, синтетические арилалкиламины и синтетические аналоги арилалкиламинов испытывали на активность в тестах in vitro, способных измерять активность рецептора глутамата. Для подробного исследования были выбраны арилалкиламины, присутствующие в яде различных видов пауков. Арилалкиламины, присутствующие в этих ядах, структурно отличаются, но имеют основную структуру класса, представленного соединениями 1-3. Другие, более упрощенные синтетические аналоги в общем состоят из подходящим образом замещенных ароматических хромофорных групп, присоединенных к алкил(поли)аминовой части (см. соединения 19-69 ниже).
Был разработан первичный тест, который обеспечивает функциональный показатель активности рецептора глутамата и который делает возможным высокопроизводительный скрининг. Первичные культуры крысиных мозжечковых зернистых клеток, нагруженных флуорометрическим индикатором fura-2, использовали для измерения изменений в [Ca 2+]i, вызываемых NMDA и его коагонистом глицином. Этот тест обеспечивает чрезвычайно чувствительный и точный показатель активности NMDA-рецептора. Увеличения [Са 2+]i, вызываемые NMDA, зависят от присутствия глицина и ингибируются внеклеточным Mg2+ или антагонистами, действующими при сайтах связывания глутамата, глицина или МК-801. Увеличения [Ca2+]i, вызываемые NMDA/глицином, легко отличить от увеличений, являющихся результатом деполяризации, по их устойчивости к ингибированию блокаторами потенциал-зависимых Са2+-каналов. Точность, с которой измерения [Са 2+]i подтверждают результаты, полученные электрофизиологическими исследованиями и исследованиями связывания лиганда, предполагает, что такие измерения близко отражают активацию комплекса NMDA-рецептор-ионофор.
Пример 1: Сильнодействующее неконкурентное ингибирование функции NMDA-рецептора
Измеряли предпочтительные ингибиторные действия арилалкиламинов на медиируемое NMDA-рецептором увеличения [Са2+]i в культивируемых крысиных мозжечковых зернистых клетках. Увеличения [Са2+]i вызывали добавлением NMDA/глицина (50 мкМ/1 мкМ) в присутствии или в отсутствие различных концентраций каждого из тестируемых соединений. Величины IC50 получали для каждого тест-соединения с использованием от 2 до 8 отдельных экспериментов на тест-соединение, и уровень стандартной ошибки был менее 10% от средней величины для каждого соединения.
Все испытанные арилалкиламины ингибировали увеличения [Са2+]i в мозжечковых зернистых клетках, вызываемые NMDA/глицином. Некоторые арилалкиламины, сходные по структуре с соединением 1 или соединением 2, были почти такими же сильнодействующими, что и МК-801 (IC50 =34 нМ), который является наиболее сильнодействующим соединением, предпочтительно ингибирующим NMDA-рецепторы, согласно литературе. Соединение 3 имело IС50=2 нМ, т.е. было в 17 раз более сильным, чем конкурентные антагонисты, такие как АР5 (IС 50=15 мкМ). Ингибирующие действия арилалкиламинов не снимались увеличением концентраций NMDA или глицина. То есть, не наблюдали изменения в ЕС50 ни для NMDA, ни для глицина. Таким образом, арилалкиламины являются неконкурентными антагонистами при комплексе NMDA-рецептор-ионофор и не действуют ни при сайте связывания глутамата, ни при сайте связывания глицина.
Пример 2: Активность против функции рецептора каината и АМРА
Измерения [Ca2+]i в мозжечковых зернистых клетках могут быть также использованы для наблюдения активации нативных рецепторов каината и АМРА, присутствующих в этой ткани. Хотя увеличения [Ca2+]i, вызываемые этими агонистами, имеют меньший размер, чем вызываемые NMDA/глицином, такие ответы являются сильными и могут быть использованы для точной оценки специфичности действия арилалкиламинов на фармакологически определенные подтипы рецептора глутамата. Сравнительные измерения [Ca2+]i выявили четкое различие в избирательности рецептора арилалкиламинами. Некоторые, такие как JSTX-3 (токсин паука Joro из паука Nephila clavata), были более сильными антагонистами ответов, вызываемых каинатом (100 мкМ) или АМРА (30 мкМ). С другой стороны, было обнаружено, что арилалкиламины в двух структурных классах, определяемых соединением 1 и соединением 2, ингибировали предпочтительно ответы, вызываемые NMDA (показывая приблизительно 100-кратное различие в силе действия). Таким образом, арилалкиламины, такие как соединение 1 и соединение 2, являются сильнодействующими и избирательными ингибиторами медиируемых NMDA-рецептором ответов в мозжечковых зернистых клетках.
Пример 3: Электрофиэиологические (patch clamp) исследования
Электрофизиологические исследования на выделенных нейронах коры или гиппокампа из мозга взрослых крыс обеспечили дополнительное понимание механизма действия соединения 1, соединения 2 и соединения 3. Эти исследования выявили сильное и избирательное ингибиторное действие арилалкиламинов на ответы, опосредованные NMDA-рецепторами. Так, соединения, такие как соединение 1, ингибировали ответы на NMDA при наномолярных концентрациях без влияния на ответы, вызываемые каинатом. Эти результаты, показывающие избирательные ингибирующие действия арилалкиламинов в нейронах коры головного мозга и гиппокампа, указывают на то, что арилалкиламины нацелены на NMDA-рецепторы в отличающихся районах в ЦНС млекопитающих. Кроме того, было обнаружено, что ингибирующие эффекты этих соединений были зависимыми от использования и потенциал-зависимыми. Это позволяет предположить, что эти соединения блокируют открытый канал и посредством этого действия ведут себя как неконкурентные антагонисты NMDA-рецепторов. Однако важно, чтобы арилалкиламины можно было отличать как от Мg2+, так и от МК-801, особенно в отношении потенциал-зависимости их появления действия и обратимости эффекта.
Пример 4: Тесты связывания радиолиганда
Исследования связывания радиолиганда показали, что арилалкиламины, такие как соединение 1 и соединение 2, имеют уникальный сайт действия. Хотя они действуют подобно МК-801 в некотором отношении (неконкурентное ингибирование открытого канала, обсуждаемое выше), они не могут заменять связывание [3H] МК-801 при концентрациях, которые полностью блокируют опосредованные NMDA-рецептором ответы. Тесты, подобные этим, показывают также, что арилалкиламины не связываются с высокой аффинностью с известными сайтами связывания МК-801, Мg2+ или полиамина на комплексе NMDA-рецептор-ионофор. Также арилалкиламины не связываются непосредственно с сайтами связывания глутамата, глицина или сигма-связывающим сайтом при концентрациях, которые ингибируют опосредованные NMDA-рецептором ответные реакции. В качестве радиолиганда синтезировали [ 3H] соединение 2 для применения в исследованиях по связыванию для дальнейшего выяснения механизма действия соединения 2 и, в частности, для применения в высокопроизводительном скрининге для оценки активности других аналогов и для обнаружения новых ведущих (основных) структур. Подобный подход был использован для [3H] соединения 5. Ясно, что соединения, подобные соединению 1 и соединению 2, нацелены на сайт на NMDA-рецептор-ионофорном комплексе, для которого в настоящее время не существует других известных соединений. Новый сайт действия арилалкиламинов на этом молекулярном уровне транслируется в заметные терапевтические преимущества на поведенческом уровне. Как описано выше, арилалкиламины обладают очень отличающимся поведенческим профилем от других неконкурентных антагонистов NMDA-рецептора.
Пример 5: Исследования синаптической передачи нервного импульса
Описанные выше открытия показывают, что некоторые арилалкиламины, в частности родственные по структуре соединению 1 и соединению 2, действуют через новый механизм и сайт действия для сильного и селективного ингибирования медиируемых NMDA-рецептором ответов на нейронах из нескольких различных участков мозга. Для дальнейшей оценки избирательных ингибиторных действий арилалкиламинов оценивали их действия на синаптическую передачу нервного импульса, медиируемую рецепторами NMDA или АМРА.
Медиируемую глутаматом передачу нервных импульсов при синапсах коллатеральных волокон Шаффера и пирамидных клеток СА1 измеряли в срезах мозга крысы, содержащих гиппокамп. Этот тест измеряет электрофизиологически, постсинаптическую деполяризацию, вызываемую пресинаптическим высвобождением глутамата, и может легко различить синаптическую трансмиссию, медиируемую рецепторами NMDA или АМРА. Опять было обнаружено, что арилалкиламины, подобные соединению 1, соединению 2 и соединению 3, проявляли предпочтительные ингибиторные действия на NMDA-рецептор-медиируемые ответы и подавляли медиируемые АМРА-рецепторами ответы при гораздо более высоких концентрациях. Например, соединение 1 имело IC 50 для NMDA-рецептор-медиируемого ответа 20 мкМ, но IС 50 Для АМРА-рецептор-медиируемого ответа 647 мкМ. Эти результаты показывают, что арилалкиламины могут избирательно ингибировать синаптическую трансмиссию возбуждения рецепторами NMDA. Другие природно-встречающиеся арилалкиламины, присутствующие в яде Agelenopsis aperta, также проявляют сильные и селективные ингибиторные действия на медиируемые NMDA-рецептором ответы в гиппокампе крысы.
Взятые вместе результаты этих различных исследований являются дополняющими друг друга и вместе идентифицируют новый класс соединений с сильной и селективной ингибиторной активностью в отношении NMDA-рецепторов в ЦНС млекопитающих. Кроме того, эти соединения нацелены на уникальный сайт на NMDA-рецептор-ионофорном комплексе. Соединение 1, соединение 2 и соединение 3 были выбраны для дополнительного исследования в различных тестах in vitro и in vivo, которые моделируют терапевтически важные конечные цели.
Нейропротекторная активность
Желательные свойства нейропротекторного лекарственного средства включают следующее. (1) Лекарственное средство может вводиться перорально или инъекцией (т.е. оно не разрушается значительно в желудке, кишечнике или сосудистой системе и, следовательно, достигает тканей, которые должны быть подвергнуты лечению, в терапевтически эффективном количестве). Такие лекарственные средства легко испытывать на грызунах для определения их биодоступности. (2) Лекарственное средство проявляет нейропротекторную активность (т.е. эффективность) при предоставлении после ишемического инсульта (удара, асфиксии) или травматического повреждения (травмы головы, повреждения спинного мозга). (3) Лекарственное средство не имеет побочных действий или имеет минимальные побочные действия, такие как ухудшение познавательной способности, нарушение двигательной способности, седативный эффект или повышенная возбудимость, вакуолизация нервных клеток, сердечно-сосудистая активность, РСР-подобный потенциал злоупотребления или РСР-подобную психотомиметическую активность.
Хотя глутамат представляет собой физиологический синаптический нейротрансмиттер (нейромедиатор), хроническое экспонирование с глутаматом ведет к гибели нервных клеток. Большинство нейродегенеративных состояний, вызываемых глутаматом, по-видимому, опосредовано NMDA-рецепторами и является непосредственным результатом хронически повышенных уровней Са2+ в цитозоле. В настоящее время имеется сильное экспериментальное подтверждение мнения, что рецепторы NMDA и АМРА играют основную роль в медиировании дегенерации нейронов после удара (кровоизлияния) и других ишемических/гипоксических событий (Choi, Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron 1: 623, 1988). Большая часть этих доказательств основана на способности конкурентных и неконкурентных антагонистов рецептора NMDA или АМРА эффективно ингибировать гибель нервных клеток в моделях ишемического удара как in vitro, так и in vivo. Поэтому соединение 1, соединение 2 и соединение 4 испытывали на нейропротекторные действия в стандартных тестах для обнаружения такой активности.
Пример 6: Защита кортикальных нейронов
Для оценки нейропротекторного действия арилалкиламинов in vitro кортикальные нейроны мышей, выращенные в культуре, выдерживали в течение 5 минут с NMDA и гибель клеток после 24 часов наблюдали путем измерения высвобождения лактатде-гидрогеназы (LDH), цитоплазматического фермента, который высвобождается из погибающих клеток (Choi et al., Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. J. Neurosci. 7: 357, 1987). Выдерживание с NMDA убивало приблизительно 80% кортикальных нейронов. Соединение 1 или соединение 2, введенные вместе с NMDA, предотвращали гибель клеток с величинами IC 50 70 мкМ и 30 мкМ соответственно. Эффективные концентрации арилалкиламинов являются более высокими, чем эффективные концентрации других неконкурентных антагонистов NMDA-рецептора, но сходными с эффективными концентрациями конкурентных антагонистов. Эффективные концентрации антагонистов NMDA-рецептора варьируют в зависимости от конкретных экспериментальных условий и от типа исследованных клеток (кортикальных клеток, клеток гиппокампа, клеток полосатого тела). Нейропротекторное действие, вероятно, является результатом способности этих соединений ингибировать приток внеклеточного Са2+, запускаемый NMDA-рецептором.
Более строгое испытание для определения потенциальной терапевтической эффективности было проведено на моделях ишемического удара in vivo. В этих моделях подачу крови временно блокировали пережиманием основных артерий, идущих к мозгу. Две модели in vivo такого типа использовали для определения способности соединения 1, соединения 2 и соединения 4 предотвращать потерю нервных клеток.
Пример 7: Билатеральная окклюзия сонной артерии
Первым тестом была модель ишемии переднего мозга у песчанок, вызываемой билатеральной окклюзией общей сонной артерии (Karpiak et al., Animal models for the study of drugs in ischemic stroke. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29: 403, 1989; Ginsberg and Busto, Rodent models of cerebral ischemia. Stroke 20: 1627, 1989). Ток крови к мозгу был прерванным в течение 7 минут зажиманием сонных артерий. Тестируемые соединения вводили в виде разовой дозы внутрибрюшинно (i.p.) через 30 минут после возобновления кровотока. Во время хода этого эксперимента животных поддерживали при 37° С для предотвращения какой-либо гипотермической реакции. Было показано, что многие антагонисты NMDA-рецептора вызывают гипотермию и этот эффект мог составлять большую часть защитного эффекта этих соединений. Мозг испытывали на гибель нервных клеток через 4 дня после этого путем окрашивания серебром срезов мозга и количественного определения гибели при помощи морфометрического анализа. Соединение 2 (20 мг/кг) значимо (р<0,05) защищало от гибели нервные клетки во всех исследованных участках мозга (районе СА1 гиппокампа, полосатом теле и неокортексе). Такие низкие дозы, как 1 мг/кг, давали полную защиту (>98%) полосатого тела. Степень защиты сравнима с достигаемой с такими же дозами неконкурентного антагониста NMDA-рецептора, МК-801.
В последующих экспериментах соединение 1 (10 мг/кг) давало 23%-ное уменьшение количества гибели нейронов в районе СА1 гиппокампа песчанки, измеренное при 7 днях пост-ишемии, тогда как соединение 4 (10 мг/кг) обеспечило 90%-ную защиту.
Пример 8: Окклюзия средней мозговой артерии
Модель ишемического удара средней мозговой артерии, выполняемая на крысах (Karpiak et al., Animal models for the study of drugs in ischemic stroke. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29: 403, 1989; Ginsberg and Busto, Rodent models of cerebral ischemia. Stroke 20: 1627, 1989), отличается от модели песчанок, поскольку она приводит к более ограниченному церебральному инфаркту и приближается поэтому к приступам другого типа (очаговому тромботическому повреждению). В первом исследовании с применением этой модели одномозговую артерию подвергали перманентной окклюзии хирургическим лигированием. Тест-соединения вводили через 30 минут после окклюзии в виде разовой внутрибрюшинной (i.p.) инъекции. В ходе этих экспериментов температуру внутри тела животных поддерживали при 37° С для предотвращения какой-либо гипотермической реакции. Мозг оценивали гистологически на потерю нервных клеток спустя 24 часа. Объемы инфаркта рассчитывали по площади гистологической бледности из 10 слайдов и интегрировали расстояние между последовательными срезами. Было обнаружено, что одна доза (30 мг/кг) соединения 1 значимо (р<0,05) защищает против потери нервных клеток, так же как и максимальная эффективная доза (10 мг/кг), МК-801 (приблизительно 15%-ная защита). Предварительные исследования с соединением 2 (20 мг/кг) показали сходную тенденцию.
Во втором исследовании очаговой церебральной ишемии у крыс среднюю мозговую артерию подвергали перманентной окклюзии проведением небольшого куска шовной нити через сонную артерию до участка средней мозговой артерии. Температуру внутри тела поддерживали при 37° С. Соединение 4, 10 мг/кг i.р., введенное сразу же после появления ишемического события, давало статистически значимое уменьшение объема инфаркта мозга (20%), зарегистрированное спустя 24 часа.
В третьей модели очаговой церебральной ишемии у крыс ишемический инфаркт индуцировали фототромботическим способом с применением красителя Rose Bengal. Соединение 4, 10 мг/кг i.р., введенное через 30 минут после ишемического события, давало 20%-ное уменьшение объема инфаркта, сходное с уменьшением, наблюдаемым с неконкурентным антагонистом NMDA-рецептора, МК-801.
В четвертой модели очаговой церебральной ишемии у крыс среднюю мозговую артерию временно закупоривали проведением небольшого куска шовной нити через сонную артерию к району средней мозговой артерии. Шовную нить вытаскивали после ишемического периода 2 часа. Температуру внутри тела поддерживали при 37° С. Соединение 4, введенное при 10 мг/кг i.p. после появления ишемического события, давало статистически значимое уменьшение объема инфаркта мозга (37%), регистрируемое спустя 72 часа.
Из этих результатов, полученных in vivo, очевидны несколько важных свойств основных соединений. Во-первых, что наиболее важно, соединение 1, соединение 2 и соединение 4 демонстрируют нейропротекторные эффекты в нескольких различных моделях ишемии in vivo. Тест на песчанках является моделью временной общей мозговой ишемии и гипоксии, такой как остановка сердца или перинатальная гипоксия. Тесты на крысах являются моделями перманентной и временной очаговой церебральной ишемии. Обнаружение, что соединение 1 и соединение 4 являются нейропротекторными в моделях перманентного очагового инфаркта, является неожиданным, вследствие того, что доступ лекарственного средства к месту инфаркта ограничен затененным участком (penumbral region), который обычно не является большим. Тем не менее соединение 1 и соединение 4 значимо (р<0,05) ограничивали степень повреждения. Во-вторых, эти соединения эффективны при введении их после ишемического события. Это является важным, поскольку считают, что имеется "окно благоприятной возможности" после инфаркта, во время которого лекарственные средства могут эффективно останавливать некротическое повреждение. Насколько длителен этот период времени у людей, не было точно определено, и он, по-видимому, изменяется в зависимости от типа инфаркта. Однако существенным является наблюдение, что эти соединения могут предотвращать распространение гибели нервных клеток, как только начался этот дегенеративный процесс. Наконец, соединения 1, 2 и 4 являются эффективными при парентеральном введении, что свидетельствует о том, что они могут преодолевать гематоэнцефалический барьер.
Противосудорожная активность
Желательные свойства противосудорожного лекарственного средства включают в себя следующие свойства: лекарственное средство может вводиться перорально или посредством инъекции, лекарственное средство проявляет эффективную противосудорожную активность против нескольких типов эпилептических припадков, в том числе но не только, простых эпилептических парциальных припадков, сложных эпилептических парциальных припадков, эпилептического статуса и индуцированных травмой припадков, таких, какие встречаются после повреждения головы, в том числе хирургии головы; и лекарственное средство не должно иметь побочных действий или имеет минимальные побочные действия, такие как ухудшение познавательной способности, седативный эффект или повышенная возбудимость, вакуолизация нейронов, сердечно-сосудистая активность, РСР-подобный потенциал злоупотребления или РСР-подобная психотомиметическая активность.
Глутамат представляет собой основной медиатор возбуждения в мозгу и, следовательно, может играть основную роль в активности эпилептических припадков и участвовать в патогенезе эпилепсии. Много доказательств в пользу основной роли рецепторов глутамата в эпилепсии получено из фармакологических исследований, демонстрирующих, что агонисты рецептора глутамата вызывают эпилептические припадки и что антагонисты рецептора NMDA или АМРА являются эффективными противосудорожными средствами при введении их in vivo. Имеются многочисленные модели in vivo различного рода эпилептических припадков и поведенческих эффектов, которые относятся к клинически различным формам эпилепсии. Таким образом, благоразумным было бы испытание на эти эффекты в нескольких моделях, поскольку может быть сверх упрощением предполагать, что один и тот же механизм лежит в основе всех форм эпилептических припадков.
Пример 9: Блокирующая конвульсант активность
В исходных исследованиях испытывали способность арилалкил-аминов блокировать эпилептические припадки, индуцируемые каинатом, пикротоксином или бицукуллином. Каждый из этих вызывающих судороги агентов (конвульсантов) действует по отличающемуся механизму, и эпилептические припадки, индуцируемые каинатом, качественно отличаются от припадков, индуцируемых пикротоксином или бицукуллином. В этих экспериментах фракцию яда Agelenopsis aperta, содержащую некоторые арилалкиламиновые токсины, вводили внутривенно (iv) за 5 минут перед введением пикротоксина или бицукуллина и за 5 минут после введения каината. Арилалкиламины уменьшали эпилептические припадки, индуцируемые всеми тремя агентами. Эффекты пикротоксина или бицукуллина были настолько тяжелыми, что все 19 контрольных животных погибли в пределах 25 минут. В противоположность этому не было гибели среди 9 животных, предварительно получивших арилалкиламины. Фактически только половина животных, получивших арилалкиламины, обнаружила вообще судороги, и эти симптомы ослабевали в пределах часа. Эти результаты показывают отчетливые противосудорожные эффекты арилалкиламинов и побудили авторов к дальнейшим исследованиям с использованием очищенных арилалкиламинов и их аналогов.
Пример 10: Стимулы, вызывающие эпилептические припадки
Три различных индуцирующих припадки тест-примера использовали первоначально в этой второй группе исследований, и такие арилалкиламины, как соединение 1, оказались эффективными в двух таких тест-примерах. Первые две модели использовали мышей DBA/2, которые склонны к аудиогенным эпилептическим припадкам. Припадки вызывали звуком (тоном звонка при 109 дБ) или внутрибрюшинным (i.p.) введением NMDA (56 мг/кг). Тестируемые вещества вводили за 15-30 минут перед стимулом, вызывающим эпилептический припадок (конвульсантом). Число клонических судорог регистрировали в течение 1 минуты после аудиогенного стимула или в течение 15 минут после введения NMDA. Соединение 1, соединение 2 и некоторые другие арилалкиламины, такие как соединение 3 и соединение 4, подавляли судороги, вызываемые каждым стимулом. Например, соединение 2 имело ED50 0,13 мг/кг s.c. для аудиогенного стимула и 0,083 мг/кг s.c. для NMDA-стимула. Подобным образом ED50 для соединения 4 в аудиогенной модели эпилептического припадка (0,08 мг/кг) приближалось к ED 50 для МК-801 (0,02 мг/кг). В противоположность этому ни соединение 1, ни соединение 2 не было эффективным при дозах до 50 мг/кг в уменьшении эпилептических припадков в мышах CF-1, вызываемых NMDA (i.р.).
Во второй независимой серии экспериментов было обнаружено, что соединение 1 и соединение 4 предотвращают эпилептические припадки, индуцированные звуком в другой модели рефлекторной эпилепсии генетически чувствительной мыши (Frings мыши), после внутрибрюшинной инъекции с величинами IC5 14,3 мг/кг и ~15 мг/кг соответственно. Эти соединения были значительно более сильнодействующими против аудиогенных эпилептических припадков в мышах Frings после интрацеребровентрикулярной (i.c.v.) инъекции, с величинами IC50 0,63 мкг (соединение 1) и 4,77 мкг (соединение 4). Было также обнаружено, что соединение 1 является эффективным против эпилептических припадков, вызываемых максимальным электрошоком в мышах CF-1 при дозе 4 мкг (i.c.v.).
В дальнейших исследованиях с использованием модели рефлекторной эпилепсии генетически чувствительной мыши (мыши Frings) соединение 9, соединение 12 и соединение 14, вводимые i.c.v. инъекцией, предотвращали индуцируемые звуком эпилептические припадки с величинами IC 50 4,77 мкг, 12,2 мкг и 13,9 мкг соответственно.
Эти взятые вместе открытия демонстрируют, что арилалкиламины, такие как соединение 1, соединение 2 и соединение 4, являются эффективными в предотвращении эпилептических (аудиогенных) и не эпилептических (вызываемых химическими агентами) припадков. Этот общий характер активности предполагает, что арилалкиламины клинически применимы в контролировании эпилептических припадков. Кроме того, эффективность соединения 1, соединения 2 и особенно соединения 4 в моделях эпилептической активности in vivo показывает, что эти соединения могут иметь терапевтические эффекты при парентеральном введении в низких дозах и являются особенно эффективными при введении непосредственно в желудочки мозга.
Аналгезирующая активность
Желательные свойства болеутоляющего лекарственного средства таковы: лекарственное средство может вводиться перорально или инъекцией, лекарственное средство проявляет аналгезирующую активность, лекарственное средство не имеет побочных действий или имеет минимальные побочные действия, такие как ухудшение познавательной способности, нарушение двигательной способности, седативный эффект или повышенная возбудимость, вакуолизация нейронов, РСР-подобный потенциал злоупотребления или РСР-подобная психотомиметическая активность.
Опосредованные глутаматом и NMDA-рецептором ответные реакции могут играть роль в некоторых типах восприятия боли (Dickenson, A cure for wind up: NMDA receptor antagonists as potential analgesics. Trends Pharmacol. Scl. 11: 302, 1990). Таким образом, исследовали возможные аналгезирующие действия соединения 1, соединения 2, соединения 3 и соединения 4.
Пример 11: Тест со скорчиванием от боли
В первой серии экспериментов животным вводили неприятный стимул (2-фенил-1,4-бензохинон, PBQ), который вызывает ответ скорчивания (вытягивание живота). Обычно регистрируют число корчей, наблюдающихся за 5-минутный период наблюдения. Классические аналгезирующие лекарственные средства, такие как морфин, эффективны в уменьшении числа вызываемых PBQ корчей (100%-ное ингибирование скорчивающего ответа при 4 мг/кг i.p.). Нестероидные противовоспалительные средства также эффективны в этой модели. Соединение 1 (2 мг/кг), соединение 2 (2 мг/кг) и соединение 3 (1 мг/кг) подавляли реакцию скорчивания более чем на 95%, при введении s.c. или i.p. за 30 минут перед введением PBQ. Эти результаты показывают, что соединение 1, соединение 2 и соединение 3 ослабляют висцеральную боль.
В сходной серии исследований было обнаружено, что соединение 1 и соединение 4 подавляют вызываемые уксусной кислотой корчи у мышей после инъекции i.p. с величинами IC50 10 мг/кг и 1 мг/кг соответственно.
Пример 12: Тест горячей пластинки
Соединение 1 тестировали на аналгезирующую активность: в дополнительном тесте. В этой модели аналгезирующей активности мышам вводили тест-вещества s.c. за 30 минут перед помещением их на горячую пластинку (50° С). Время до облизывания лапок или спрыгивания с пластинки является показателем аналгезирующей активности, и эффективные аналгетики увеличивают период латентного состояния до облизывания лапок или соскакивания с пластинки. Морфин (5,6 мг/кг) увеличивал период до соскакивания на 765%. Соединение 1 было также эффективно в этом тесте и при дозах 4 и 32 мг/кг увеличивало латентный период до облизывания лапок на 136% и латентный период до спрыгивания на 360% соответственно.
Следует отметить, что аналгезирующие эффекты соединения 1 в тесте горячей пластинки не сопровождались пониженной активностью в тесте с обращенной решеткой (см. ниже). Это показывает, что увеличение латентного периода для спрыгивания с горячей пластинки просто не отражает ухудшения двигательной способности. Взятые вместе эти данные предполагают, что соединение 1 обладает значительной аналгезирующей активностью.
В последней серии экспериментов было показано, что соединение 1 и соединение 4 обладают значительной аналгезирующей активностью в крысах при внутриоболочечном введении (i.th.). В этих экспериментах в качестве болевого стимула использовали горячую (52° С) пластинку. Соединение 1 (0,3-3 нмоль) и соединение 4 (0,3-3 нмоль) производили зависимое от дозы и зависимое от времени болеутоляющее действие; эти арилалкиламины были одинаковы с морфином (0,3-3 нмоль) по силе и эффективности. С другой стороны, антагонист NMDA-рецептора, МК-801, был неэффективен в этом тесте (3-30 нмоль).
Пример 13: Тест с резкими движениями хвоста
В этом стандартном тесте термический болевой стимул представлял собой нагретую до 52° С воду с латентным периодом до резкого движения хвостом или до отдергивания, взятых за конечную точку. Соединение 1 (0,3-3 нмоль) и соединение 4 (0,3-3 нмоль) обнаруживали зависимое от дозы и зависимое от времени аналгезирующее действие после введения i.th. Эти арилалкиламины были одинаковы с морфином (0,3-3 нмоль) в отношении силы действия и эффективности. С другой стороны, антагонист NMDA-рецептора, МК-801, был неэффективен в этом тесте (3-30 нмоль).
Пример 14: Формалиновый тест
Самцов крыс Sprague-Dawley приучали к камере наблюдения в течение по меньшей мере 1 часа перед получением инъекции разбавленного формалина (5%) в объеме 50 мкл в левую заднюю лапку. Поведенческие ответные реакции наблюдали сразу же после s.с. инъекции формалина в дорсальную поверхность лапки подсчетом числа вздрагиваний животного. Поведение наблюдали в течение по меньшей мере 50 минут после инъекции формалина и регистрировали как ответы ранней фазы (0-10 минут после инъекции формалина) и ответы поздней фазы (20-50 минут после инъекции формалина). Соединения инъецировали внутриоболочечно (i.th.) за 10 минут перед введением формалина (предобработка) или через 10 минут после введения формалина (пост-обработка) в объеме 5 мкл.
Введение формалина внутрь подошвы производило типичный двухфазный ответ поведения вздрагивания, обычно описываемый как ответы ранней и поздней фазы. Внутриоболочечное введение соединения 1 (0,3-10 нмоль) или соединения 4 (0,3-10 нмоль) в виде предобработки перед введением формалина эффективно ингибировало как вздрагивания ранней фазы, так и вздрагивания поздней фазы. Это действие предобработки арилалкиламинами было сходно с действием предобработки морфином (1-10 нмоль) или МК-801 (1-30 нмоль).
Соединение 1 (0,3-10 нмоль i.th.), введенное после формалина, производило некоторое ингибирование поздней фазы вздрагиваний, хотя значимость достигалась только при дозе 10 нмоль. Соединение 4 (0,3-10 нмоль), введенное после формалина, производило значимое ингибирование поздней фазы вздрагиваний, причем значимость достигалась при дозах 3 и 10 нмоль. Этот аналгезирующий профиль активности арилалкиламинов сходен с профилем введения морфина после формалина (1-10 нмоль); постформалиновое введение МК-801 (1-30 нмоль), однако, не влияло на позднюю фазу вздрагиваний.
Взятые вместе полученные результаты тестов с горячей пластинкой, резких движений хвоста и формалиновых тестов показывают, что арилалкиламины, такие как соединение 1 и соединение 4, имеют значимую аналгезирующую активность в нескольких моделях грызунов с острой болью. Формалиновый тест дополнительно демонстрирует, что арилалкиламины эффективны в моделях хронической боли животных. Важно, что арилалкиламины обладают аналгезирующей активностью при введении после формалинового стимула. Этот профиль активности явно отличает эти арилалкиламины от стандартных антагонистов NMDA-рецептора, таких как МК-801.
Побочные эффекты арилалкиламинов
При условии, что NMDA-рецепторы играют важную роль в разнообразных функциях мозга, неудивительно обнаружить, что антагонисты этого рецептора, как правило, ассоциированы с определенными нежелательными побочными эффектами. Фактически именно это свойство создает основное препятствие для разработки терапий, нацеленных на NMDA-рецепторы. Основными побочными действиями, которые свойственны как конкурентным, так и неконкурентным антагонистам, являются РСР-подобная психотомиметическая активность, ухудшение двигательной активности, седативный эффект или повышенная возбудимость, ухудшение познавательной способности, вакуолизация нервных клеток или сердечно-сосудистые эффекты (Willets et al., The Behavioral pharmacology of NMDA receptor antagonists. Trends Pharmacol. Sci. 11: 423, 1990; Olney et al., Patological changes induced in cerebrocortical neurons by phencyclidine and related drugs. Science 244: 1360, 1989). Психотомиметический эффект, ассоциированный с ингибированием опосредованных NMDA-рецептором ответных реакций, возникает в ответ на фенциклидин (РСР) или "ангельский порошок", который действует при сайте связывания МК-801. Нарушение познавательной способности ассоциировано с важной ролью, которую NMDA-рецепторы обычно играют в обучении и памяти.
Относительно меньше известно в отношении профиля побочных эффектов антагонистов рецептора АМРА. Однако становится ясно, что такие соединения также вызывают ухудшение двигательной активности, атаксию и сильный седативный эффект.
Активность арилалкиламинов испытывали в моделях животных, которые показывают ухудшение двигательной активности, седативную и психотомиметическую активность, а также в моделях познавательной способности и памяти in vitro и in vivo.
(а) РСР-подобная психотомиметическая активность
В грызунах как конкурентные, так и неконкурентные антагонисты NMDA-рецептора вызывают РСР-подобное стереотипическое поведение, характеризующееся гиперактивностью, верчением головы из стороны в сторону и атаксией (Willets et al., The behavioral pharmacology of NMDA receptor antagonists. Trends Pharmacol. Sci. 11: 423, 1990; Snell and Johnson, In: Excitatory Ammo Acids in Health and Disease, John Wiley and Sons, p.261, 1988). Заявители исследовали, вызывают ли арилалкиламины такое поведение. Кроме того, заявители исследовали, будут ли арилалкиламины заменять РСР в крысах, обученных отличать РСР от солевого раствора (Willets et al., The behavioral pharmacology of NMDA receptor antagonists. Trends Pharmacol. Sci. 11: 423, 1990), и вызывают ли арилалкиламины РСР-подобную вакуолизацию нейронов (Olney et al., Pathological changes induced in cerebrocortical neurons by phencyclidine and related drugs. Science 244: 1360, 1989).
Пример 15: Опорно-двигательная активность
В первом тесте просто наблюдают опорно-двигательную активность во время первых часов после периферического введения (s.c. или i.p.) тест-вещества. Мыши получали дозу соединения 1 за 15 минут перед помещением в камеры для определения активности. Активность измеряли количественно подсчетом числа прерываний в сетке фотоэлементов за период 60 минут. В этом тесте МК-801 (0,25 мг/кг р.о.) вызывает 2-3-кратное увеличение в опорно-двигательной активности. Однако соединение 1, даже при тестировании при 32 мг/кг s.c., не вызывало повышенной активности и фактически имело тенденцию ее подавления. Этот результат, полученный с применением очищенного арилалкиламина в мышах, дополняет более ранние результаты, полученные в крысах, где вся содержащая арилалкиламины фракция из Agelenopsis aperta при внутривенном введении не вызывала РСР-подобного поведенческого синдрома, а по-видимому, производила мягкое седативное действие.
Пример 16: Ухудшение двигательной функции
В первом тесте на общее ухудшение двигательной функции соединение 1 испытывали в тесте с перевернутой сеткой. В этом тесте животных помещали на сетку с проволочными отверстиями, подвешенную от вращающегося металлического стержня, которая может быть перевернута. Затем животных оценивали в баллах на их способность взбираться наверх или удерживаться на сетке. Этот тест обеспечивает показатель "поведенческого нарушения", которое может быть результатом атаксии, потери выпрямительного рефлекса, седативного эффекта или миорелаксации. В этих тестах соединение 1, введенное при 32 мг/кг s.c., не ухудшало способность мышей DBA/2 самостоятельно выпрямляться при переворачивании сетки (р>0,05). Соединение 2 также не действовало (р>0,05) на двигательную способность в мышах DBA/2 при введении при дозе 20 мг/кг s.c. Эти дозы значительно выше доз, которые требовались для предотвращения индуцируемых звуком рефлекторных эпилептических припадков у мышей DBA/2 (см. пример 10 выше).
Второй тест острого ухудшения двигательной способности был тест с вращающимся стержнем. В этом тесте мышей Frings и CF1 инъецировали тест-соединением и помещали на насеченный стержень, который вращается при скорости 6 об/мин. Определяли способность мышей сохранять равновесие в течение длительных периодов времени. Мышей, которые были неспособны сохранять равновесие на вращающемся стержне в течение 1 минуты в каждом из трех испытаний, считали имеющими нарушения. Соединение 1 производило острое двигательное нарушение в мышах Frings с TD50 (доза, которая дает моторную токсичность у 50% тестированных животных) 16,8 мг/кг i.p. Эта доза одинакова с дозой, которая предотвращает индуцируемые звуком эпилептические припадки в мышах Frings (см. пример 10 выше). Однако существует гораздо более явное разделение между эффективными и токсическими дозами соединения 1 в случае мышей Frings при введении соединения i.c.v. В этом случае не наблюдали явной моторной токсичности до тех пор, пока доза соединения 1 не превысила 1,56 мкг i.c.v. (> в два раза, чем ED50 0,63 мкг). Наконец, ухудшение двигательной способности у мышей CF1 наблюдали с соединением 1 после введения i.c.v. 4 мкг.
Соединение 4, соединение 9, соединение 12 и соединение 14 вводили мышам Frings i.с.v.-инъекцией и измеряли острое нарушение двигательной функции. Величины TD50 для Соединений 4, 8, 12 и 14 были 8-16 мкг, 14,8 мкг, 30,2 мкг и 30,8 мкг соответственно. Эти величины ТD50 были в 2-3 раза выше, чем эффективные величины IC50 для противосудорожной эффективности (см. пример 10 выше); отмечали явное разделение между эффективной и токсической дозами.
Пример 17: Различение РСР
В этом тесте крысы, которые были приучены поднимать рычагом пресс для пополнения запаса корма, должны выбрать, который из двух рычагов в их клетках является правильным. Единственным стимулом, который они имеют для выбора правильного рычага, является их способность обнаруживать, получили они инъекцию РСР или инъекцию носителя. После приблизительно двух месяцев тренировки крысы начинают очень хорошо отличать РСР от инъекций носителя и после этого их можно тестировать с другими лекарственными средствами для определения, могут ли они их отличать как РСР. При тестировании по этому способу РСР заменяют другими лекарственными средствами, которые, как известно, производят РСР-подо