СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ ГЕПАРИНА

Изобретение относится к области химии и биохимии, в частности, к способу получения новых веществ, производных гепарина, которые могут быть использованы в медицине, фармакологии. Способ осуществляют путем взаимодействия его с аминосодержащими соединениями в присутствии конденсирующего реагента 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида в водной среде при комнатной температуре, рН 4.7-4.8. В качестве аминосодержащих соединений используют ряд фармакологически значимых аминов: n-аминофенол, n-аминобензойную и антраниловую кислоты, 4- и 5-аминосалициловые кислоты, стрептоцид, сульфацил-натрий, анестезин, новокаин, таурин (тауфон), 7-аминоцефалоспориновую кислоту, а также изониазид (гидразид изоникотиновой кислоты). В зависимости от природы аминосодержащего соединения и соотношения реагентов получают водорастворимые модифицированные гепарины с различной конверсией карбоксильных групп. Преимуществами предлагаемого способа получения конъюгатов гепарина является осуществление реакции за короткий промежуток времени, позволяющий достигать высокой конверсии карбоксигрупп гепарина, использование при этом небольших избытков реагентов: гепарин: RNH2 :EDC=1:(1-3):(0.75-3.00). Варьирование соотношения реагентов позволяет получать модифицированные гепарины с заданной степенью конверсии карбоксигрупп. Следует отметить легкость очистки конъюгатов от низкомолекулярных примесей и хорошую растворимость продуктов в воде. 1 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области химии и биохимии, в частности, к способу получения новых веществ, производных гепарина, которые могут быть использованы в медицине, фармакологии.

Гепарин, природный сульфатированный полисахарид из класса гликозаминогликанов, состоит из повторяющихся единиц 6-сульфат-2-дезокси-2-сульфамино-D-глюкопиранозы и 2-сульфат-L-идопиранозилуроновой кислоты, находится в печени, легких, селезенке, слизистой оболочке кишечника и щитовидной железе высших животных. Молекулярная масса гепарина находится в пределах от 3000 до 40000 Да. Гепарин широко используется в медицине в качестве антикоагулянта и антитромботического средства. Кроме антикоагулянтных и антитромботических у гепарина выявлены антибактериальные, антивирусные, противовоспалительные [Бычков С.М. Новые данные о гепарине. // Вопросы медицинской химии. 1981. №6. С.726-735] и противоопухолевые свойства [Lapierre F., Holme К., Lam L. Chemical modification of heparin that diminish anticoagulant but preserve its heparanase-inhibitory, angiostatic, anti-tumor and anti-metastatic properties. // Glycobiology 1996. V.6(3). P.355-366]. Обнаружено также ингибирующее действие гепарина на рост и репликацию вируса иммунодефицита человека [Rider С.С. The potential for heparin and its derivatives in the therapy and prevention of HIV-1 infection. // Glycoconj. J. 1997. V.14(5). P.639-642].

Фармакопейные препараты гепарина для внутривенного введения выпускаются в виде натриевой и кальциевой солей. Гепариновую мазь применяют наружно при поверхностных тромбофлебитах и язвах конечностей, тромбозе геморроидальных вен: при этом уменьшаются воспалительные процессы. Низкомолекулярный гепарин (Фраксипарин, Эндоксапарин Натрия, Сулодексид; Mn=3000-4500 Да) применяется в хирургической и ортопедической практике и является, в отличие от гепарина с Mn=14-18 тыс. Да, препаратом пролонгированного действия [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - Харьков: Торсинг, 1997. - Т.1, 2. - 590 С.].

В последние годы проявляется большой интерес к получению и исследованию биологических свойств химически модифицированных аналогов гепарина. Функционализация гепарина позволяет изменить физико-химические и биологические свойства гепарина. Конъюгаты гепарина с лекарственными субстанциями могут обладать большей растворимостью или продолжительностью действия по сравнению с самими лекарствами, могут использоваться как препараты комбинированного действия.

Амфифильные производные гепарина, способные абсорбироваться желудочно-кишечным трактом, были синтезированы с участием N-гидроксисукцинимидных эфиров некоторых стеролов, желчных и алифатических кислот [Amphiphilic polysaccharide derivatives, US 6245753]. Также были получены нитропроизводные низкомолекулярного гепарина [Nitro-derivatives of low molecular weight heparin, EP 1340771] и эпоксигепарина [Nitro-derivatives of epoxyheparin, EP 1340772 A1], которые могут применяться в лечении патологий, связанных с дисфункцией сердечно-сосудистой системы. Известны различные десульфатированные [Process for producing desulfated polysaccharide, and desulfated heparin, US 6, 545, 136 B1] и суперсульфатированные [Yates E.A., Santini F., Guerrini M., Naggi A., Torri G., Casu B. 1H and 13C NMR spectral assignments of the major sequences of twelve systematically modified heparin derivatives // Carbohydrate Res. 1996. V.294. P.15-27] аналоги гепарина, которые проявляют антипролиферативную и антикоагулянтную активность, отличающуюся от исходного гепарина.

При разработке гемосовместимых тромборезистентных материалов наиболее часто применяется ковалентное связывание гепарина с натуральной или искусственной полимерной матрицей. Например, карбоксильные группы гепарина при помощи водорастворимого 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида были ковалентно связаны с аминогруппами желатина или смеси желатина и альбумина, используемых для покрытия сосудистых протезов. При этом ковалентно связанный гепарин проявлял антипролиферативную активность [Laemmel E., Penhoat J., Warocquier-Clerout R., Sigot-Luizard M.F. Heparin immobilized on proteins usable for arterial prosthesis coating: growth inhibition of smooth-muscle cells // J. Biomed. Mater. Res. 1998. - V.39 (3). - Р.446-452].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения конъюгата гепарина с дигидразидом адипиновой кислоты, предназначенного для последующей реакции с некоторыми стероидами с глюкокортикоидной и минералокортикоидной активностью [Derbyshire E.J., Yang Y-C., Li Sh., Comin G.A., Belloir J., Thorpe F.E. Heparin-steroid conjugates lacking glucocorticoid or mineralocorticoid activities inhibit the proliferation of vascular endothelial cells // Biochimica et Biophysica Acta. 1996. V.1310. P.86-96]. Карбоксильные группы гепарина реагируют с аминогруппами дигидразида адипиновой кислоты (берется большой избыток) в присутствии 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (EDC) в водной среде при комнатной температуре (рН 4.75) с образованием соответствующего конъюгата (мольные отношения реагентов авторами не указаны), который очищали от низкомолекулярных примесей диализом и затем лиофилизировали. Удается ввести в молекулу гепарина не более 10 гидразидных остатков, что составляет ˜50% мольн. в расчете на дисахаридное звено гепарина. Далее свободные аминогруппы гидразида гепарина использовали в реакции с кортикостероидами.



Целью предлагаемого изобретения является способ получения фармакозначимых конъюгатов гепарина с соединениями, содержащими первичную аминогруппу, путем их взаимодействия с гепарином в водной среде (рН 4.7-4.8) в присутствии 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (EDC). В качестве аминосодержащих соединений были использованы фармакологически значимые n-аминофенол, 5- и 4-аминосалициловые, антраниловая и n-аминобензойная кислоты, этиловый эфир n-аминобензойной кислоты (анестезин), -диэтиламиноэтиловый эфир n-аминобензойной кислоты (новокаин), гидразид изоникотиновой кислоты (изониазид), 2-аминоэтансульфоновая кислота (таурин), 7-аминоцефалоспориновая кислота, а также сульфаниламидные препараты, содержащие свободную аминогруппу, такие как n-аминобензолсульфамид (стрептоцид), n-аминобензолсульфацетамид-натрий (сульфацил-натрий). Конъюгация перечисленных аминосодержащих соединений с гепарином позволяет расширить арсенал производных гепарина, придать ему дополнительные медикаментозные свойства: противовоспалительные, антимикробные, анестезирующие. Преимуществами предлагаемого способа получения конъюгатов гепарина также является осуществление реакции за короткий промежуток времени, позволяющий достигать высокой конверсии карбоксигрупп гепарина (в некоторых случаях до 100% мольн. в расчете на дисахаридное звено), использование при этом небольших избытков регентов: гепарин:RNH2 :EDC=1:(1-3):(0.75-3.00). Варьирование соотношения регентов позволяет получать модифицированные гепарины с заданной степенью конверсии карбоксигрупп. Следует отметить легкость очистки конъюгатов от низкомолекулярных примесей и хорошую растворимость продуктов в воде.



где R=С6Н 4ОН (остаток п-аминофенола), С6Н 4СООН (остатки п-аминобензойной и антраниловой кислот), С6Н3(ОН)СООН (остатки 4- и 5-аминосалициловых кислот), C6H 4SO2NH2 (остаток п-бензолсульфамида), С6Н 4SO2N(Na)СОСН3 (остаток п-аминобензолсульфацетамид-натрия), С 6Н4СООС2Н 5 (остаток этилового эфира п-аминобензойной кислоты), С 6Н4COO(СН2) 2N(С2Н5) 2 (остаток бета-диэтиламиноэтилового эфира п-аминобензойной кислоты), C5H4NCONHNH 2 (остаток гидразида изоникотиновой кислоты), Н 2NCH2СН2SO 3Н (остаток 2-аминоэтансульфоновой кислоты), C 9O5NSH10 (остаток 7-аминоцефалоспориновой кислоты),

R1 =NHSO3 - или NHAc (20-30%)

Пример 1. К смеси 91,8 мг (0.15 ммоль) гепарина (ГЕП) и 0.15 ммоль соответствующего амина в 15 мл Н 2О добавляют 0.1 н. NaOH (или, если требуется, 0.1 н. HCl) до pH 4.7-4.8, затем при интенсивном перемешивании и температуре 20-22°С вносят 21.5 мг (0.11 ммоль) карбодиимида (соотношение реагентов ГЕП:амин:EDC=1:1:0.75), поддерживая pH 4.7-4.8 титрованием 0.1 н. HCl. Через 0.5 ч к охлажденной до 0°С реакционной смеси последовательно добавляют 0.1 н. NaOH (до pH 7), 2-3 мл насыщенного раствора NaCl и 60-65 мл охлажденного этанола, после чего оставляют на ночь при 0°С. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 мл 6% NaCl, добавляют 40 мл этанола. Вновь выпавший осадок центрифугируют, промывают этанолом (10×3 мл), затем эфиром (10×3 мл) и сушат при температуре 60°С и пониженном давлении. Получают ˜100 мг соответствующих конъюгатов в виде белых порошков с розовым или желтым оттенком, растворимых в воде.

Пример 2. Реакцию гепарина с соответствующим амином проводят аналогично примеру 1, но при этом используют следующее соотношение реагентов: ГЕП:амин:EDC=1:1:1.5, т.е. к 91.3 мг (0.15 ммоль) гепарина прибавляют 0.15 ммоль соответствующего амина и 43 мг (0.22 ммоль) карбодиимида.

Пример 3. Реакцию гепарина с соответствующим амином проводят аналогично примеру 1, но при этом используют следующее соотношение реагентов: ГЕП:амин:EDC=1:3:3, т.е. к 91.3 мг (0.15 ммоль) гепарина прибавляют 0.45 ммоль соответствующего амина и 86.3 мг (0.45 ммоль) карбодиимида.

Конверсию карбоксильных групп гепарина определяют по данным 1Н-ЯМР-спектроскопии, используя в качестве внутреннего стандарта интенсивность сигналов аномерных протонов исследуемого образца модифицированного гепарина в области 5.3-5.5 м.д.

Спектры 1Н-ЯМР регистрировали для растворов в D2О на спектрометре Bruker АМХ-300 (рабочая частота для 1Н-ЯМР-300.13 МГц), в качестве внутреннего стандарта использовали натриевую соль 3-(триметилсилил)-1-пропансульфоновой кислоты. УФ-спектры получали на спектрофотометре Specord M-40. Контроль рН растворов проводили с помощью рН-метра «рН-340».

Характеристика конъюгатов гепарина с рядом фармакологически значимых аминосодержащих соединений: n-аминофенолом, n-аминобензойной, антраниловой, 5-аминосалициловой и 4-аминосалициловой кислотами, анестезином и новокаином, стрептоцидом, таурином, 7-аминоцефалоспориновой кислотой, изониазидом, сульфацил-натрием приводится в таблице.

Таблица 
RNH2 Конверсия карбоксильных групп ГЕП (%) при различных соотношениях реагентов УФ-спектр: (H2 O, max, нм) 
ГЕП:амин:EDC=1:1:0.75 ГЕП:амин:EDC=1:1:1.5 ГЕП:амин:EDC=1:3:3 
n-аминобензойная кислота 53* 83* 90* 298, 317 или 333 в зависимости от конверсии СООН-групп 
антраниловая кислота 52 75 75 259 и 303 
5-аминосалициловая кислота 39 64 86 317 
4-аминосалициловая кислота 27 28 61 268 и 306 
n-аминофенол 40 52 56 246 
стрептоцид 36 48 86 258 
сульфацил-натрий 51 80 100 263 
анестезин 75 100 100 271 
новокаин 66 93 100 273 
изониазид 45 100 100 266 
7-аминоцефалоспориновая кислота 24 50 100 264 
таурин 15 29 44 - 
*В конъюгатах гепарина обнаружены димерные и тримерные фрагменты n-аминобензойной кислоты (подтверждено данными 13С-ЯМР-спектроскопии). 






ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ получения конъюгатов гепарина путем его взаимодействия с аминосодержащими соединениями в водной среде, рН 4,7-4,8, в присутствии конденсирующего реагента 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (EDC), отличающийся тем, что в качестве аминосодержащих соединений (RNH2) используют n-аминофенол, n-аминобензойную и антраниловую кислоты, 4- и 5-аминосалициловые кислоты, стрептоцид, сульфацил-натрий, анестезин, новокаин, изониазид, 2-аминоэтансульфоновую кислоту (таурин), 7-аминоцефалоспориновую кислоту при мольных соотношениях компонентов гепарин: RNH2:EDC=1:(1-3):(0.75-3.00), смесь интенсивно перемешивают при 20-22°С в течение 30 мин, затем охлаждают до 0°С, доводят рН до 7, насыщают NaCl, добавляют охлажденный этанол, оставляют на ночь при 0°С, выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают этанолом и эфиром и сушат при температуре не выше 60°С и пониженном давлении.