СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
(51) 7 G01N33/15, G01N27/26
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 15.02.2008 - действует
--------------------------------------------------------------------------------
(21) Заявка: 2003123072/15
(22) Дата подачи заявки: 2003.07.25
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.07.25
(45) Опубликовано: 2004.10.20
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: RU 2170930 С1, 20.07.2001. RU 2163021 С1, 10.02.2001. RU 2033609 С1, 20.04.1995. RU 2140988 С1, 10.11.1999. RU 2102757 С1, 20.01.1998. RU 2008680 С1, 28.02.1994.
(72) Автор(ы): Пахомов В.П. (RU); Яшин Я.И. (RU); Яшин А.Я. (RU); Багирова В.Л. (RU); Арзамасцев А.П. (RU); Кукес В.Г. (RU); Ших Е.В. (RU)
(73) Патентообладатель(и): Закрытое акционерное общество "АП Химавтоматика" (RU); Проблемная лаборатория по разработке, изучению, внедрению, производству и маркетингу лекарственных средств РАМН (RU)
Адрес для переписки: 129345, Москва, ул. Тайнинская, 15, корп.1, кв.52, Я.И. Яшину
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Изобретение относится к области фармакологии, фармации и может быть использовано для оценки антиоксидантной активности (АОА) различных многокомпонентных смесей без их предварительного разделения. Способ включает подготовку проб анализируемого и стандартного веществ, их электрохимическое окисление в ячейке амперометрического детектора, усиление электрических сигналов их регистрацию и расчет АОА по предложенной математической зависимости. Способ позволяет оценить суммарную антиоксидантную активность с высокой точностью и воспроизводимостью и с использованием простого и доступного оборудования. 3 з.п. ф-лы, 1 ил.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к области медицины, фармакологии, фармации и может быть использовано для оценки антиокислительной активности различных лекарственных препаратов, пищевых продуктов и БАДов. Антиоксидантная активность (потенциал) лекарственного препарата есть показатель качества препарата, характеризующий его восстанавливающие свойства, т.е. свойства вступления в реакцию с активными формами кислорода (АФК), как in vivo так in vitro, которые образуются в организме в присутствии кислорода, при его неполном восстановлении с образованием следующих радикалов:
- супероксидный анион-радикал (О 1/2);
- гидропероксидный радикал (СНОО)
- пероксид водорода (Н2О2)
- гидроксил радикал (НО) и др.
В случае гипероксидации АФК организма могут выступать в роли радикалов, атакующих липиды в клеточных мембранах, белки тканей, энзимы, полисахариды и ДНК.
Процесс старения и тяжелые заболевания связаны с повреждением организма человека активным кислородсодержащим радикалами, особенно при их избытке или при снижении активности эндогенной антиоксидантной системы организма человека.
Для поддержания необходимой концентрации в организме свободных радикалов и используются лекарственные препараты, биологически активные вещества, в том числе в виде пищевых продуктов или БАДов.
Известен способ определения антиоксидантной активности, в котором измеряется общее хемилюминесцентное изменение спустя 3 с от момента добавления к перекиси водорода гипохлорида натрия в присутствии биологически активного вещества в сравнении с контролем. Способ позволяет ускорить анализ и расширить круг исследуемых веществ (RU 2033609, 20.04.1995).
Известен способ определения антиокислительной активности вещества путем спектральной оценки их способности подавлять появление ОН-радикалов в реакции Фентон, где оценку осуществляют по интенсивности хемилюминесценции реакции Фентон по формуле А=(А0-А+)/А0, где А0 - максимальная амплитуда хемилюминесценции реакции Фентон при отсутствии испытуемого вещества, А+ - максимальная амплитуда свечения реакции в присутствии испытуемого вещества и при значениях А>0,3 делают вывод об антиоксидантных свойствах у испытуемого вещества (RU 2163021, 10.02.2001).
Недостатком известных способов является образование люминесцирующих веществ также из индивидуальных соединений и отсутствие избирательности к окислительным веществам в сложных многокомнентных системах (комплексные лекарственные препараты, экстракты из лекарственных растений, БАДы и пищевые продукты).
Известен способ определения суммы антиокислительных веществ, таких как фенольные соединения, с помощью фотометрического титрования по Левенталю, основанный на окислении в кислой среде перманганатом калия в присутствии индикатора индигокармина, являющегося регулятором реакции окисления. Для расчета используют коэффициент, равный 6,792 мг суммы фенольных соединений хмеля и соответствующий 1 мл 0,1 H раствора перманганата калия.
Недостатком способа является то, что фенольные соединения представляют собой не единственные действующие вещества растений и фитопрепаратов на их основе - настоев, отваров, эликсиров, настоек, которые реагируют с перманганатом калия. (Ляшенко Н.И. и др. Методы количественного определения полифенолов в хмеле. Хмелеводство, в.2, Киев, Урожай, 1980, с.57-64).
Известен способ определения антиокислительной активности индивидуальных веществ, основанный на электрохимическом поглощении кислорода, например, активность 1,5Д-антифруктозы определяют в эмульсии метилового эфира лимонной кислоты. Окислительную реакцию в системе инициируют добавлением раствора метиоглобина. Непосредственно после инициирования реакции образец инжектируют в термостатированную (25,00,1С) закрытую ячейку, обеспечивая при этом надежную защиту от попадания в систему кислорода. Поглощение кислорода определяют по электроду Кларка, который подсоединен к управляемой компьютером базе данных. Относительную концентрацию (%) кислорода определяют через каждые 30 с (см. описание к RU 2140988, 10.11.1989). Данный способ не пригоден к определению суммарной антиокислительной активности препаратов. Вообще способы, использующие на конечной стадии спектроскопическое детектирование, в большинстве случаев используются в сочетании с методами жидкостной хроматографии и применяются для количественного определения конкретного вещества, обладающего антиокислительными свойствами. (Grosset С. Cantin P. Alarys. Количественное определение в галеновых формах антиоксидантов методом жидкостной хроматографии. //Analusis, 1989, 17, № 7, р.409-412).
Данный способ имеет следующие недостатки: метод определения косвенный, включает в себя несколько этапов, и, как следствие, достаточно продолжительный по времени. Сложность оборудования, требующего для обслуживания специалиста и оборудованного места установки. Достаточно высокий процент ошибки определения.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ, позволяющий определить суммарную антиокислительную активность биологически активных веществ, который заключается в подготовке дозы анализируемого и стандартного веществ, их окислении и расчете антиокислительной активности по формуле, в частности, что 0,05 H раствор перманганата калия в 0,024 М растворе серной кислоты титруют при комнатной температуре раствором анализируемой пробы до обесцвечивания и расчет концентрации БАВ проводят по формуле в пересчете на кверцетин.
Показателем относительной АОА служит объем препарата (объекта) в миллилитрах, израсходованный на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия. Чем меньше объем препарата, израсходованный на титрование, тем выше антиокислительная активность препарата. Для количественной оценки АОА препаратов (объектов) вводится показатель активности - В. Эта величина представляет собой сумму БАВ восстанавливающего характера и выражается количеством миллиграммов кверцетина в 1 мл или 1 г препарата (объекта). Чем выше величина В, тем более высокой АОА обладает объект (RU 2170930, 20.07.2001). Недостатком способа, выбранного за прототип, является титрование перманганатом калия в препарате веществ, не обладающих восстановительным потенциалом, а следовательно, не участвующем в ингибировании активных радикалов.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа, позволяющего с высокой точностью и воспроизводимостью, оценивать суммарную антиоксидантную активность фармацевтических препаратов, лекарственных растений, биологически активных добавок и пищевых продуктов (чай, вино, пиво, соки). Способ должен быть простым в применении и не слишком дорогим.
Поставленная задача решается описываемым способом определения антиоксидантной активности биологически активных веществ, который включает подготовку доз анализируемого и стандартного веществ, их электрохимическое окисление путем непосредственной поочередной подачи подготовленных доз в термостатируемую электрохимическую ячейку амперометрического детектора с получением сигналов в виде соответствующих импульсов электрического тока, усиление сигналов, регистрацию в виде выходных кривых и расчет площадей полученных пиков анализируемого (S) и стандартного (Sст) веществ, при этом расчет показателя антиоксидантной активности (АОА) осуществляют по следующей формуле:
где Sa - площадь пика анализируемого препарата; Sc - площадь пика стандарта; mс - навеска стандарта; Vc - объем раствора стандарта, мл; Р - чистота используемого стандарта, %; n - разбавление анализируемого препарата.
Предпочтительно подготовку анализируемых проб осуществляют путем смешения соответствующих веществ с растворителем, не обладающим антиоксидантной способностью. Способ предусматривает, что в качестве стандартных веществ используют вещества, обладающие высоким редокс-потенциалом. Например, в качестве стандартных веществ используют вещества, выбранные из ряда: кверцетин, дигидрокверцитин, рутин.
В основе предложенного способа использовано свойство антиоксидантов, как активных восстановителей, имеющих различный "редокс-потенциал". Например: Редокс-потенциал кверцетина = 0,3 В. Редокс-потенциал дигдрокверцитина = 0,5 В. Редокс-потенциал рутина = 0,6 В.
Использовать стандартное вещество можно достаточно точно определить редокс-потенциал любых многокомпонентных препаратов, имеющих еще большее различие в антиокислительной активности.
Предложенный способ применим к исследуемым объектам в жидком состоянии. Твердые вещества перед анализом переводят в жидкие формы.
Для осуществления способа создана установка, изображенное схематически на чертеже.
Установка содержит
1 - емкость для растворителя;
2 - насос;
3 - кран-дозатор;
4 - амперометрический детектор с термостатируемой электрохимической ячейкой;
5 - усилитель электрического сигнала;
6 - аналого-цифровой преобразователь;
7 - регистрирующее устройство (компьютер с принтером);
8 - устройство ввода анализируемого и стандартного веществ.
Установка работает следующим образом: насос (2) прокачивает растворитель из емкости (1) через всю систему. В кран-дозатор стандартным шприцем на 1 мл вводят исследуемый раствор (8). Поток растворителя подает дозу исследуемого вещества в ячейку детектора (4). В ячейке происходит электрохимическое окисление вещества на поверхности рабочего электрода. При этом возрастает ток между двумя электродами. Возникающие токи малы (10-16-10-9 А), поэтому они усиливаются в устройстве (5), с помощью аналого-цифрового преобразователя (6) преобразуются в цифровой сигнал и регистрируются на дисплее компьютера (7).
Ниже приведены конкретные примеры осуществления способа с использованием вышеописанной установки.
ПРИМЕР 1
1 мл лекарственного препарата "Иммунал" вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл доводят объем колбы водой до метки и перемешивают. 20 мкл полученного раствора вручную или с использованием автоматического дозатора вводят в кран-дозатор установки, в котором проба смешивается с проходящим растворителем и насосом подается непосредственного в термостатируемую электрохимическую ячейку амперометрического детектора, с получением от него соответствующего сигнала в виде импульса электрического тока, усилением этого импульса и его графической регистрации в виде дифференциальной кривой (площадь пика Sn), одновременно проводится подготовка 100 мл раствора стандартного вещества антиоксиданта (рутин чистоты-98%), обладающего высоким редокс-восстанавливающим потенциалом, который также вводят в кран дозатор и проба поступает на тот же детектор с выдачей импульса в виде площади пика (Sc), a количественную оценку антиоксидантной активности (АОА) анализируемого вещества проводят расчетным путем по следующей математической зависимости:
где Sn - площадь пика анализируемого препарата;
sст - площадь пика стандарта рутина;
n - разбавление анализируемого препарата;
mc - навеска стандарта рутина, мг;
Vc - объем приготовленного раствора стандарта антиоксиданта рутина, мл.
Найдено экспериментально:
Площадь пика у препарата "Иммунал" Sn=396,0
Площадь пика у стандарта рутина Sc=165,0
ПРИМЕР 2
ЗЕЛЕНЫЙ ЧАЙ. 5 г (точная навеска) зеленого чая заливают 200 мл нагретой до кипения дистиллированной водой, накрывают часовым стеклом и настаивают в течение 5 мин, затем полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр "белая лента", охлаждают и доводят объем до 200 мл водой (раствор для анализа). Раствор через дозатор подают в электрохимическую ячейку детектора. Получение площадей анализируемого чая и стандарта рутина, а также количественный расчет величины АОА проводят, как в примере № 1, в расчете на 1 мл или на 1 г сухого чая.
Для анализируемого сорта зеленого чая
АОА=3,92 мг/мл или 157 мг/г сухого зеленого чая.
Аналогичным образом проведены исследования по оценке антиоксидантной активности различных веществ. Результаты представлены в примерах 3-5.
ПРИМЕР 3
ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ЭЛИКСИР "ФИТОИММУНАЛ"
Определение площадей пиков препарата и стандарта рутина, а также количественный расчет АОА проводится как в примере 1.
Для анализируемого образца препарата "Фитоиммунал"
АОА=7,42 мг/мл
ПРИМЕР 4
КОНЬЯК "ДАГЕСТАНСКИЙ"
Определение площадей пиков анализируемого коньяка и стандарта рутина, а также количественный расчет АОА проводится как в примере 1
Для анализируемого образца коньяк "Дагестанский"
АОА - 1,18 мг/мл
ПРИМЕР 5
ЧЕРНЫЙ ЧАЙ
Приготовление извлечения и определение исследуемых пиков извлечения и стандарта рутина, а также количественный расчет АОА проводится как в примере 2.
Для анализируемого сорта черного чая.
АОА - 6,4 мг/л или 256 мг/г черного чая.
Проведенные измерения показали, что предложенный способ прост в применении и в зависимости от анализируемого объекта обладает высокой воспроизводимостью и точностью, что превышает аналогичные характеристики способа-прототипа.
Результаты предложенного способа могут быть использованы в лечебной практике для правильной дозировки лекарственных веществ и БАДов в организм человека, а также для надежной стандартизации лекарственных препаратов, лекарственных растений и БАДов. Поскольку антиоксидантная активность - интегральный показатель качества, то было бы целесообразно ввести такой показатель в нормативные документы (ГОСТ, ТУ, Фармстатьи и т.д.)
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ определения антиоксидантной активности биологически активных веществ, включающий подготовку проб анализируемого и стандартного веществ, их окисление и расчет показателя антиоксидантной активности, отличающийся тем, что окисление анализируемого и стандартного вещества проводят электрохимически путем непосредственной поочередной подачи подготовленных проб в термостатируемую электрохимическую ячейку амперометрического детектора с получением сигналов в виде соответствующих импульсов электрического тока, усиление сигналов, регистрацию в виде дифференциальных выходных кривых и расчет площадей полученных пиков анализируемого (S) и стандартного (Sст) веществ, при этом расчет показателя антиоксидантной активности (АОА) осуществляют по следующей формуле:
где Sa - площадь пика анализируемого препарата;
Sc - площадь пика стандарта;
mс - навеска стандарта;
Vc - объем раствора стандарта, мл;
Р - чистота используемого стандарта, %;
n - разбавление анализируемого препарата.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что подготовку анализируемых проб осуществляют путем смешения соответствующих веществ с растворителем, не обладающим антиоксидантной способностью.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве стандартных веществ используют вещества, обладающие высоким редокс-потенциалом.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве стандартных веществ используют вещества, выбранные из ряда: рутин, кверцитин, дигидрокверцитин.
Независимый научно технический портал
На главную страницу раздела
