СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСТОТЫ АДЕНОЗИНА И ФОСФАДЕНА
(51) 7 G01N33/52
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 05.10.2007 - прекратил действие, но может быть восстановлен
--------------------------------------------------------------------------------
(14) Дата публикации: 2000.08.20
(21) Регистрационный номер заявки: 98112965/14
(22) Дата подачи заявки: 1998.07.07
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1998.07.07
(45) Опубликовано: 2000.08.20
(56) Аналоги изобретения: ТУ-12.10.89, Аденозин-1,5-водный для аденозинтрифосфорной кислоты. ФС 42-1960-83. Фосфаден. RU 1737337 A1, 30.05.92. БОБКОВА С.А. и соавт. Определение макроэргических фосфатов и использование микроЭВМ для подсчета их концентрации в тканях сердца//Актуальные вопросы сердечно-сосудистой патологии в Молдавской ССР: сб.науч.тр. - Кишинев, 1988, с. 99 - 112.
(71) Имя заявителя: Иркутский государственный медицинский университет
(72) Имя изобретателя: Ловцева Е.А.; Беликов В.Г.
(73) Имя патентообладателя: Иркутский государственный медицинский университет
(98) Адрес для переписки: 664003, г.Иркутск, ул. Красного восстания 1, ИГМУ, патентный отдел
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСТОТЫ АДЕНОЗИНА И ФОСФАДЕНА
Изобретение может быть использовано в медицине, а именно в контрольно-аналитических лабораториях для стандартизации и контроля качества лекарственных средств. Готовят растворы испытуемого образца и растворы веществ сравнения. Используют хроматографирование в тонком слое сорбента. В качестве неподвижной фазы используют силикагель, а в качестве подвижной фазы систему растворителей: воду очищенную с добавлением 25%-ного раствора аммиака в соотношении 100 : 1 - в случае контроля чистоты фосфадена и воду - 25%-ный раствор аммиака - ледяную уксусную кислоту в соотношении 100 : 0,25 : 0,5 в случае контроля чистоты аденозина. Способ повышает чувствительность анализа и позволяет уменьшить продолжительность одного испытания.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предлагаемое изобретение относится к области медицины и может быть использовано в контрольно-аналитических лабораториях для стандартизации и контроля качества лекарственных средств.
Одной из актуальных проблем фармацевтического анализа является разработка новых и совершенствование существующих способов контроля качества лекарственных средств.
Объектами настоящего исследования были выбраны аденозин и фосфаден. Одним из требований нормативно-технической документации для оценки чистоты фосфадена и аденозина является отсутствие специфических примесей. Аденозин и фосфаден в качестве возможных специфических примесей могут содержать производные пурина, близкие к действующим веществам по химической структуре и физико-химическим свойствам, такие как аденин и аденозин в фосфадене и инозин и ацетилинозин в аденозине. Нормативно-техническая документация рекомендует определение специфических примесей, являющихся производными пурина, проводить методом хроматографии на бумаге.
Известен способ оценки чистоты аденозина и фосфадена, принятый нами за прототип, который заключается в приготовлении водных растворов испытуемых веществ с последующим нанесением их на хроматографическую бумагу, хроматографированием в системе растворителей пропанол - 25% раствор аммиака - вода в соотношении 7: 1:2 и обнаружением путем облучения хроматограммы УФ-светом (см. ТУ-12-10-89, Аденозин-1,5-водный для аденозинтрифосфорной кислоты; ФС 42-1960-83 "Фосфаден").
Рекомендованный нормативно-технической документацией метод хроматографии на бумаге, применяемый для контроля чистоты аденозина и фосфадена, характеризуется длительностью и низкой чувствительностью. Продолжительность одного испытания - 18-20 часов.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение чувствительности способа и уменьшение времени анализа.
Технический результат достигается путем приготовления водных растворов определяемых веществ с последующим их хроматографированием и обнаружением с помощью УФ-света. Новым в достижении технического результата является то, что используют хроматографию в тонком слое сорбента, причем в качестве сорбента используют силикагель. Новым является и то, что в качестве подвижной фазы используют воду очищенную с добавлением растворов аммиака и ледяной уксусной кислоты.
Исследуемые лекарственные вещества и возможные примеси характеризуются наличием в молекулах различных функциональных групп и поэтому отличаются по физико-химическим свойствам. Исходя из этого оптимальным методом их разделения следует считать метод хроматографии в тонком слое сорбента, который характеризуется экспрессностью, селективностью и высокой чувствительностью (Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. - М.: Мир, 1965. - 542 с.)
На основании изучения особенностей строения аденозина, фосфадена и их возможных примесей было установлено, что оптимальное разделение исследуемых веществ может быть достигнуто при использовании в качестве сорбента силикагеля. Он является кислым сорбентом и позволяет разделить вещества, учитывая различия в их кислотно-основных свойствах.
Для обнаружения исследуемых объектов на хроматограммах использовали раствор о-толидина и облучение УФ-светом (длина волны 254 нм.). Провели сравнение чувствительности обнаружения зон исследуемых веществ указанными способами. Чувствительность обнаружения веществ УФ-светом и о-толидиновым реактивом составила соответственно 0,5 и 2 мкг. Поэтому в дальнейшем детектирование их на хроматограммах осуществляли с помощью ультрафиолетового осветителя типа "ВИО-1" (светофильтры УФС-1, УФС-2) длина волны 254 нм.
С помощью математического планирования эксперимента метода "латинского квадрата" установлено, что на хроматографическое поведение аденозина, фосфадена и возможных примесей влияют полярность растворителя и интервал pH среды. Учитывая факторы, влияющие на хроматографическую подвижность исследуемых веществ, а также различия в их кислотно-основных свойствах и гидрофильности, в качестве основного компонента подвижной фазы выбрана вода очищенная. При хроматографировании в воде фосфаден, аденозин и аденин имеют Rf соответственно 0,6; 0,58 и 0,3. Для разделения аденозина и фосфадена использовали их различие в химических свойствах. Поэтому в состав подвижной фазы вводили ледяную уксусную кислоту в различных соотношениях с водой. Однако оптимальной подвижной фазы с ледяной уксусной кислотой не нашли, так как зона фосфадена имела вытянутую форму. В дальнейшем хроматографирование проводили, добавляя к воде 25%-ный раствор аммиака.
В результате проведенных экспериментов найдена подвижная фаза вода - 25%-ный раствор аммиака (100:10), позволяющая разделить фосфаден, аденозин и получить зоны веществ правильной формы. Результаты хроматографирования аденозина, инозина и ацетилинозина в воде очищенной показали, что испытуемые вещества отделяются друг от друга. Однако целесообразно было увеличить Rf между зонами. Это было достигнуто путем добавления в подвижную фазу ледяной уксусной кислоты и 25%-ного раствора аммиака. Установлено, что оптимальной подвижной фазой для контроля чистоты аденозина является система вода - 25%-ный раствор аммиака - ледяная уксусная кислота (100:0,25:0,5).
Сопоставительный анализ показывает, что заявляемое техническое решение отличается тем, что используют тонкослойную хроматографию, причем в качестве сорбента - силикагель, а в качестве подвижной фазы - воду очищенную с добавлением раствора аммиака и ледяной уксусной кислоты, что соответствует критерию изобретения "новизна".
Новая совокупность признаков обеспечивает повышение чувствительности анализа, исключает использование токсичных органических растворителей и уменьшает время одного испытания до 30 минут, что соответствует критерию "промышленная применимость".
При анализе известных решений было выявлено, что в них отсутствуют сведения о влиянии отличительных признаков на достижение поставленного технического результата, следовательно, изобретение соответствует критерию "изобретательский уровень". Способ осуществляют следующим образом. Готовят раствор испытуемого лекарственного вещества. Для этого 0,01 г препарата растворяют в 2 мл воды. 0,02 мл (100 мкг) приготовленного раствора капилляром наносят на линию старта хроматографической пластины "Армсорб" или "Сорбфил". После высушивания пластинку помещают в хроматографическую камеру с системой растворителей вода - 25%-ный раствор аммиака (100:1) в случае контроля чистоты фосфадена и вода - 25%-ный раствор аммиака - ледяная уксусная кислота (100: 0,25:0,5) в случае анализа аденозина и хроматографируют восходящим методом. После хроматографирования пластинку помещают в сушильный шкаф (t = 100-105oC) на 5 минут, а затем просматривают в УФ-свете (длина волны 254 нм). На хроматограмме должно быть темное пятно фосфадена с Rf 0,900,03 или аденозина с Rf 0,650,03.
Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.
Готовят растворы испытуемого образца и растворы веществ-свидетелей, которые могут выступать как специфические примеси, описанным выше способом. Хроматографируют испытуемые растворы, используя оптимальные системы растворителей. Далее обнаруживают зоны веществ на хроматограмме УФ-светом.
При контроле чистоты фосфадена на хроматограмме обнаружена только одна зона, соответствующая основному действующему веществу с Rf 0,88. Зоны свидетелей имели Rf 0,6 (аденозин), 0,35 (аденин).
Испытуемый образец аденозина имел на хроматограмме одно темное пятно, соответствующее аденозину с Rf 0,65. Зоны свидетелей имели Rf 0,9 (инозин) и 0,4 (ацетилинозин). Анализируемые образцы аденозина и фосфадена специфических примесей не имеют.
Данные примеры подтверждают, что предлагаемый способ может быть использован для контроля чистоты аденозина и фосфадена и испытуемые образцы этих лекарственных веществ соответствуют требованиям нормативного документа.
Таким образом, предлагаемый способ контроля чистоты аденозина и фосфадена с использованием тонкослойной хроматографии позволяет повысить чувствительность анализа, уменьшить продолжительность одного испытания в 30-40 раз и исключает применение токсичных органических растворителей.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ определения чистоты аденозина и фосфадена путем приготовления растворов определяемого вещества, хроматографирования и обнаружения с помощью УФ-света, отличающийся тем, что используют хроматографию в тонком слое сорбента, причем в качестве сорбента используют силикагель, а в качестве подвижной фазы используют систему растворителей вода - 25% раствор аммиака в соотношении 100 : 1 в случае контроля чистоты фосфадена и вода - 25% раствор аммиака - ледяная уксусная кислота в соотношении 100 : 0,25 : 0,5 в случае контроля чистоты аденозина.
Независимый научно технический портал
На главную страницу раздела
