ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, АКТИВНАЯ В ОТНОШЕНИИ РЕЦЕПТОРА КАЛЬЦИЯ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТА, СПОСОБ АНАЛИЗА СОЕДИНЕНИЯ ОКАЗЫВАТЬ ВЛИЯНИЕ НА АКТИВНОСТЬ РЕЦЕПТОРА НЕОРГАНИЧЕСКОГО ИОНА, НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ РЕЦЕПТОР, РЕЦЕПТОР КАЛЬЦИЯ
(51) 7 A61K31/00, A61K31/13, A61K31/135, A61K31/405, C12N15/11, C12N15/12
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 17.09.2007 - действует
--------------------------------------------------------------------------------
(14) Дата публикации: 2000.03.10
(21) Регистрационный номер заявки: 94036778/14
(22) Дата подачи заявки: 1993.02.23
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1993.02.23
(45) Опубликовано: 2000.03.10
(56) Аналоги изобретения: WO 91/00851, 23.01.91. US 5021551, 05.06.91. "Calcium binding Proteins in Heflth and Disease", Acad. Press. Jnc., N.-J. 1987, p.33 - 35.
(71) Имя заявителя: Брихэм энд Уимен З Хоспитал, Инк. (US); Эн-Пи-Эс Фармасьютикалз, Инк. (US)
(72) Имя изобретателя: Эдвард Ф.Немет (US); Эдвард М.Браун (US); Стивен К.Хеберт (US); Брэдфорд К. Ван Вейгенен (US); Мануель Ф.Баландрин (US); Форрест Х.Фуллер (US); Эрик Г.Дел Мар (US)
(73) Имя патентообладателя: Брихэм энд Уимен З Хоспитал, Инк. (US); Эн-Пи-Эс Фармасьютикалз, Инк. (US)
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 1994.04.20
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: US 93/01642 (23.02.1993)
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 94/18959 (01.09.1994)
(98) Адрес для переписки: 129010, Москва, ул.Б.Спасская, 25, стр.3, СОЮЗПАТЕНТ
(54) ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, АКТИВНАЯ В ОТНОШЕНИИ РЕЦЕПТОРА КАЛЬЦИЯ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТА, СПОСОБ АНАЛИЗА СОЕДИНЕНИЯ ОКАЗЫВАТЬ ВЛИЯНИЕ НА АКТИВНОСТЬ РЕЦЕПТОРА НЕОРГАНИЧЕСКОГО ИОНА, НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ РЕЦЕПТОР, РЕЦЕПТОР КАЛЬЦИЯ
Изобретение относится к медицине, точнее препаратам и способам лечения и исследования, связанным с рецепторами кальция и др. неорганических ионов. Предпочтительно молекула способна воздействовать как селективный агонист или антагонист на Са+2-рецептор одной или более, но не всех клеток, выбранных из группы, состоящей из паратироидных клеток, костных остеокластов, окологломерулярных почечных клеток, проксимальных канальцевых почечных клеток, периферических канальцевых почечных клеток, клеток толстой восходящей ветви петли Хенля и/или собирающей протоки, кератиноцита в эпидермисе, парафолликулярной клетки в тироиде (С-клеток), интестинальных клеток, трофобласта в плаценте, тромбоцита, клетки сосудов гладкой мышцы, клетки сердечного предсердия, клеток, секретирующих гастрин и глюкагон, почечной, мезангиальной клетки и клетки грудной железы. Изобретение расширяет арсенал средств, способных блокировать активность внеклеточных ионов кальция, при различных патологиях. 6 с. и. 50 з.п. ф-лы, 47 ил., 6 табл.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к конструкции, разработке, композиции и применению новых кальцимиметических молекул, способных воздействовать аналогичным образом на внеклеточные ионы кальция на клетках, к кальцилитическим молекулам, которые блокируют активность внеклеточных ионов кальция на клетки, и к способам их применения и идентификации.
Оно также относится к новому суперсемейству рецепторов неорганических ионов, которое включает среди других рецепторы кальция, нуклеиновым кислотам, кодирующим такие рецепторы, к клеткам, тканям и животным, содержащим такие нуклеиновые кислоты, к антителам к рецепторам, к анализу с использованием рецепторов и к способам, относящимся ко всему вышесказанному.
Последующее описание предоставляет краткую информацию, относящуюся к настоящему изобретению. Это не означает, что любая приведенная здесь информация представляет собой уровень техники для заявляемого изобретения, ни то, что любая из публикаций специально или безоговорочно относятся к уровню техники этого изобретения.
Некоторые клетки в организме отвечают не только на химические сигналы, но также на ионы, такие как внеклеточные ионы кальция /Ca2+/. Изменения концентрации внеклеточного Ca2+ (упоминаемой здесь как "/Ca2+/") изменяют функциональные ответы этих клеток. Одной такой специализированной клеткой является паратироидная клетка, которая секретирует паратироидный гормон /ПТГ/. ПТГ является принципиальным эндокринным фактором, регулирующим Ca2+ гомеостаз в крови и внеклеточных жидкостях.
ПТГ при действии на клетки кости и почек увеличивает уровень Ca2+ в крови. Такое увеличение /Ca2+/ затем действует как сигнал отрицательной обратной связи, подавляя секрецию ПТГ. Обратное соотношение между /Ca2+/ и секрецией ПТГ образует основной механизм поддержания гомеостаза Ca2+ в целом.
Внеклеточный Ca2+ действует непосредственно на паратироидную клетку, регулируя секрецию ПТГ. Было предположено существование белка поверхности паратироидной клетки, который определяет изменение /Ca2+/. Этот белок действует как рецептор внеклеточного Ca2+ /"рецептор Ca2+"/ и предполагают, что он определяет изменения /Ca2+/ и инициирует функциональный клеточный ответ, секрецию ПТГ. Например, роль рецепторов Ca2+ и внеклеточного Ca2+ при регулировании внеклеточного Ca2+ и функции клетки рассмотрена Неметом с сотр., 11 Cell Calcium 319, 1990, роль Ca2+-рецепторов в парафолликулярных и паратироидных клетках рассмотрена Неметом с сотр., 11 Cell Calcium 323, 1990, и роль Ca2+-рецепторов на костные остеокласты рассмотрены Зайди, 10 Biosceince Reports 493, 1990.
Другие клетки организма, особенно остеокласт в кости, окологломерулярные, проксимальные канальцевые клетки в почках, кератиноцит в эпидермисе, парафолликулярная клетка в щитовидной железе, интестинальные клетки, трофобласт в плаценте, обладают способностью чувствовать изменения /Ca2+/. Было предположено, что рецепторы Ca2+ поверхности клеток также могут присутствовать на этих клетках, придавая им способность определять и инициировать или быть способными давать ответ на изменения /Ca2+/.
В паратироидных клетках, остеокластах, парафолликулярных клетках (C-клетках), кератиноцитах, окологломерулярных клетках в трофобластах увеличение /Ca2+/ вызывает увеличение концентрации внутриклеточного свободного Ca2+ ("/Ca2+/в"). Такое увеличение может быть вызвано притоком внеклеточного Ca2+ или мобилизацией Ca2+ из внутриклеточных органелл. Изменения /Ca2+/в легко контролируются и количественно определяются при использовании флуориметрических индикаторов, таких как fura-2 или indo-1 (Molecular Probes, Eugene, OR). Измерение /Ca2+/в обеспечивает анализ для оценки способности молекул действовать как агонисты или антагонисты на рецептор Ca2+.
В паратироидных клетках увеличение концентрации внеклеточного Ca2+ вызывает быстрое и временное увеличение /Ca2+/в, за которым следует более низкое, но еще продолжительное повышение /Ca2+/в. Кратковременное повышение /Ca2+/в возникает из-за мобилизации внутриклеточного Ca2+, тогда как более низкое продолжительное повышение является результатом притока внеклеточного Ca2+. Мобилизация внутриклеточного Ca2+ осуществляется за счет повышенного образования инозитол-1,4,5-трифосфата /ИФ3/ и диацилглицерина, двух биохимических индикаторов, которые ассоциированы с рецепторзависимой мобилизацией внутриклеточного Ca2+ в других различных клетках.
В дополнение к Ca2+ другие двух- и трехвалентные катионы, такие как Mg2+, Sr2+, Ba2+, La3+ и Gd3+, также вызывают мобилизацию внутриклеточного Ca2+ в паратироидных клетках. Mg2+ и La3+ также повышают образование ИФ3, все эти неорганические катионы подавляют секрецию ПТГ. Постулированный Ca2+-рецептор на паратироидной клетке, следовательно, является смешанным, поскольку он определяет различные внеклеточные двух- и трехвалентные катионы.
Способность различных соединений подражать внеклеточному Ca2+ in vitro обсуждалась Неметом с сотр. /спермин и спермидин/ в Calcium-Binding Proteins in Health and Disease 1987, Academic Press, Inc. p.p. 33-35, Брауном с сотр. /например, неомицин/ 128, Endocrinology 3047, 1991, Ченом с сотр. /дильтиазем и его аналог, TA-3090/ 5, J. Bone and Mineral Res. 581, 1990, и Зайди с сотр. /верапамил/ 167, Biochem. Biophys Res. Comm. 807, 1990.
Браун с сотр., 6, J. Bone and Mineral Res. 11, 1991, обсуждает существующие теории, относящиеся к воздействиям ионов Ca2+ на паратироидные клетки, и предлагает, что результаты могут быть объяснены как рецепторподобным механизмом, так и рецепторнезависимым механизмом следующим образом.
Поливалентные катионы /например, двухвалентные и трехвалентные катионы/ оказывают различные воздействия на паратироидную функцию, такие как ингибирование секреции паратироиодного гормона (ПТГ) и аккумуляция цАМФ, стимуляция аккумуляции инозитолфосфатов и повышение концентрации цитозолического кальция. Полагают, что эти воздействия должны быть опосредованы через "рецепторподобный" механизм. Ингибирование агонистстимулированной аккумуляции цАМФ двухвалентными и трехвалентными катионами, например, блокируется последующей предварительной инкубацией с коклюшным токсином. Итак, putative рецептор поливалентного катиона может быть соединен для ингибирования аденилатциклазы с регуляторным белком /G/ ингибирования гуанинового нуклеотида, Gв.
Недавно мы показали, что поликатионный антибиотик, неомицин, подобен по воздействиям двух- и трехвалентным катионам в некоторых аспектах паратироидной функции. Для определения, являются ли эти воздействия специфическими для этого агента или представляют собой более общее воздействие поликатионов, мы испытали воздействия сильноосновных пептидов, полиаргинина и полилизина, а также протамина на одинаковые параметры в диспергированных бычьих паратироидных клетках. Результаты показывают, что паратироидная клетка отвечает на различные поликатионы, а также на поливалентные катионы возможно по подобным биохимическим путям. Эти результаты были обсуждены в терминах недавно постулированной, "рецепторнезависимой" модуляции белков поликатионами в других системах.
Предполагалось, что Ca2+-рецептор должен быть аналогичным другим G-белоксвязанным рецепторам /например, гликопротеин/, но недавние исследования с другими типами клеток выдвинули возможность, что поликатионы могут модулировать клеточную функцию по альтернативным или дополнительным механизмам. Например, в маст (mast) клетках различные амфипатические катионы, включая мастопаран, пептид из яда осы, 48/80, синтетический поликатион и полилизин, повышают секрецию по чувствительному к коклюшному токсину механизму, предполагая включение G-белка. Не было идентифицировано классического рецептора поверхности клетки, который мог бы медиировать воздействия этих различных агентов. Кроме того, было показано, что эти же соединения активируют непосредственно очищенные G-белки в растворе или в искусственных фосфолипидных везикулах. На основании этих наблюдений было предложено, что амфипатические катионы активируют G-белки и, в свою очередь, секрецию маст-клеток по "рецепторнезависимому" механизму.
Было также показано, что поликатионы интенсивно взаимодействуют с кислыми фосфолипидами. Полилизины с различной длиной цепи /20-1000 аминокислот/ связываются с искусственными фосфолипидными везикулами с константами диссоциации в интервале от 0,5 нМ до 1,5 М. Способность к связыванию непосредственно зависит от длины полилизиновой цепи, у полимеров из 1000 аминокислот Kd 0,5 нМ, более короткие полимеры имеют более высокие величины Kd, а лизин не вступает в реакцию в заметной степени. Такое соотношение между активностью и длиной цепи подобно наблюдаемому для эффектов полилизина10200, полилизина3800 и лизина на паратироидную функцию.
Возможно, что связыванием поликатионов с биомембранами продуцирует некоторые из их биологических действий. Было постулировано, что проницаемость плазматических мембран, индуцированная у некоторых типов клеток различными порообразующими агентами, включая поликатионы, будет способствовать их взаимодействию с фосфатидилсеринподобной структурой. Кроме того, "рецепторнезависимая" активация очищенных G-белков амфипатическими катионами будет возможной, когда эти белки включены в фосфолипидные везикулы.
Ионы кальция в миллимолярном интервале концентраций также вызывают заметные изменения структуры мембраны. В некоторых случаях кальций может или антагонизировать или усиливать взаимодействие поликатионов с мембранными липидами. Эти выводы приводят к возможности, что воздействия как поливалентных катионов, так и поликатионов на паратироидные клетки могут включать рецепторнезависимый механизм, не требующий наличия классического G-белоксвязанного рецептора на поверхности клетки. Однако требуются дополнительные исследования, чтобы объяснить молекулярную основу Ca2+ чувствительности этих и других типов клеток. /Цитирования опущены/.
Шобэк и Чен /6/ Supplement 1/, J. Bone and Mineral Res. 1991, 5135 и Pakke с сотр. /6/ Supplement 1/ J. Bone and Mineral Res. 1991, 5118/ описали эксперименты, в которых было указано, что Ca2+-рецептор или Ca2+-сенсор присутствует в паратироидных клетках. Матричная РНК, изолированная из таких клеток, может быть экспрессирована в ооцитах, и требуется получить такие ооциты с фенотипом, который может быть объяснен наличием Ca2+-рецепторного белка.
Краткое изложение изобретения
Заявитель показал, что Ca2+-рецепторные белки у определенных специализированных клеток включены целиком в Ca2+-метаболизм, чтобы определять и отвечать на изменения концентрации внеклеточного Ca2+. Хотя эти рецепторы принимают участие в некоторых общих характеристиках, они могут подвергаться селективному воздействию различных фармакологических агентов. Как будет детально описано ниже, некоторые молекулы идентифицируются по селективной активности на Ca2+-рецепторы паратироидных клеток, остеокластов и C-клеток.
Ca2+-рецепторы представляют собой дискретные молекулярные мишени для нового класса молекул, которые имитируют /"кальцимиметики"/ или антагонизируют /кальцилитики"/ воздействия внеклеточного Ca2+. Такие рецепторы находятся на поверхности клетки и имеют низкое сродство к внеклеточному Ca2+ (кажущаяся Kd обычно больше, чем примерно 0,5 мМ). Такие рецепторы могут включать механизм свободного или связанного эффектора, как определено Купером, Блумом и Ротом "The Biochemical Basis of Neuropharmacology", Ch. 4. Итак, такие рецепторы отличаются от рецепторов внутриклеточного Ca2+, например кальцимодулина и трипонинов. Кальциметики, например, действуют на Ca2+-рецепторы селективно, чтобы непосредственно или не непосредственно снизить фунцию паратироидных клеток или остеоскластов или стимулировать функцию C-клеток. Кальцимиметики и кальцилитики настоящего изобретения позволяют создать новую терапию для гиперпаратироидизма, остеопороза и других Ca2+-зависимых заболеваний. Настоящая заявка в одном аспекте относится к конъюгированию лекарственного препарата с антителом, обеспечивая ему направленную доставку препарата к Ca2+-рецепторам у каждого из этих трех типов клеток и других типов клеток, которые определяют и отвечают на изменения /Ca2+/.
Заявитель сначала продемонстрировал белок Ca2+-рецептора в паратироидных клетках и фармакологически дифференциировал такие Ca2+-рецепторы в других клетках, таких как C-клетки и остеокласты. Заявитель также в первую очередь описал способы, по которым могут быть идентифицированы молекулы, активные у этих Ca2+-рецепторов, и использованы в качестве ведущих молекул при обнаружении, разработке, конструировании, модификации и/или конструкции полезных кальцимиметиков или кальцилитиков, которые являются активными у Ca2+-рецепторов. Такие кальцимиметики или кальцилитики являются полезными при лечении различных болезненных состояний, характеризующихся аномальными уровнями одного или более компонентов, например полипептидов, таких как гормоны, ферменты или факторы роста, экспрессия и/или секреция которых регулируется или находится под воздействием одного или нескольких Ca2+-рецепторов. Далее, идентификация различных Ca2+-рецепторов в различных типах клеток и специфический ответ таких рецепторов на различные ведущие молекулы позволяет дать замысел и конструкцию специфических молекул, активных при лечении специфических заболеваний, которые могут находиться под влиянием таких специфических Ca2+-рецепторов. Например, аномальные уровни секреции паратироидного гормона могут быть подвергнуты действию таких специфических молекул без воздействия на уровни секреции других регулируемых Ca2+ гормонов и т.п.
Идентификации таких ведущих молекул препятствовало отсутствие до настоящего времени системы скрининга с большим количеством исходного материала для обнаружения активных молекул и отсутствие основных структурных данных, на базе которых конструируют эффективные кандидаты в лекарства. Теперь эти преграды сняты с помощью клонирования Ca2+-рецептора паратироидных клеток и функционально родственных рецепторов и систематического исследования структурных признаков некоторых ведущих молекул, которые активируют такие клонированные Ca2+-рецепторы и функционально родственные рецепторы. Клонирование Ca2+-рецептора также дает возможность разработать трансфекционные клеточные линии, пригодные для скрининга с большим количеством исходного материала природного продукта или молекулярных библиотек и синтетических молекул. Это вместе с исследованиями структура - активность, обсужденными выше, обеспечивает технологию, необходимую для разработки новых кальцимиметиков и кальцилитиков.
Заявитель приспособил такие процедуры в этой заявке. кДНК кальциевого рецептора бычьей паратироидной клетки была клонирована и депонирована в АТСС под номером хранения АТСС 75416. При использовании этого клона легко могут быть получены рецепторы неорганических ионов в других тканях и видовых гомологах. Например, Ca2+-рецептор человеческой паратироидной клетки может быть клонирован при скрининге библиотек нуклеиновых кислот или при скрининге функциональной экспрессии в Xenopus ооцитах и могут быть определены структурные признаки органических молекул, необходимые для активности на Ca2+-рецепторе, с помощью испытаний выбранных природных продуктов или библиотек других молекул и последующих исследований структура - активность.
Итак, в первом аспекте, изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей молекулу, которая или обладает активностью, подобной внеклеточному Ca2+, вызывая увеличение /Ca2+/в в клетке, или блокируют увеличение /Ca2+/в, вызванное внеклеточным Ca2+. Молекула имеет ЭК50 менее или равную 5 М и не является протамином.
Термин "миметический" означает, что молекула обладает одним или несколькими специфическими воздействиями внеклеточного Ca2+ на отвечающую на внеклеточный Ca2+ клетку. Термин не требует, чтобы имитировались все биологические функции внеклеточного Ca2+, но по крайней мере одну такую функцию имитируют. Кроме того, не требуется, чтобы молекула связывалась с тем же самым центром на Ca2+-рецепторе, как это делает внеклеточный Ca2+ (смотри, например, новое соединение NPS 467 и его действие в примере 20 ниже). Термин "блокировать" означает, что одно такое воздействие Ca2+ снижается или предотвращается молекулой. ЭК50 может быть определена с помощью анализа, как описано ниже, где измеряется подобная активность и концентрация молекулы, которая имитирует половину максимального мимикрирующего эффекта, является ЭК50. Наоборот, ЭК50 кальцилитика является тем количеством, которое блокирует половину максимальной активности. Предпочтительно такие анализы измеряют возрастание /Ca2+/в и подтверждают специфичность к Ca2+-рецепторам с помощью описанных ниже способов или их эквивалента.
В предпочтительных вариантах биоанализ, описанный здесь, показывает, что повышение /Ca2+/в в клетке является кратковременным, имеющим длительность менее одной минуты, и повышение /Ca2+/в является быстрым, происходящим за 30 секунд; и молекула также /а/ вызывает продолжительное (более 30 секунд) повышение /Ca2+/в, /б/ вызывает увеличение уровней инозитол-1,4,5-трифосфата и/или диацилглицерина, например, за менее чем 60 секунд, и /в/ ингибирует образование допамин- или изопротеренолстимулизованного АМФ. В дополнение к этому кратковременное увеличение /Ca2+/в устраняет предварительную обработку клетки в течение 10 минут 10 мМ фторида натрия или кратковременное повышение уменьшается при короткой предварительной обработке (не более 10 минут) клетки активатором протеинкиназы C, например форболмиристатацетатом (ФМА), мезерейном или /-/индолактамом V.
В паратироидной клетке эти молекулы, которые являются активными во всех анализах, описанных выше, являются особенно полезными в настоящем изобретении, поскольку они являются специфическими по своим воздействиям на Ca2+-рецептор такой клетки. Это особенно справедливо для описанного выше эффекта предварительной обработки ФМА.
В более предпочтительном варианте клетка является паратироидной клеткой и молекула ингибирует секрецию паратироидного гормона из клетки. Другие предпочтительные варианты включают молекулы, которые вызывают увеличение /Ca2+/в, что определяется, например, как увеличение Cl- потока, имеющегося обычно в Xenopus ооците, инъецированном мРНК из паратироидной клетки, костного остеокласта, окологломерулярной почечной клетки, проксимальной почечной канальцевой клетки, периферической канальцевой почечной клетки, клетки толстой восходящей ветви петли Хенля и/или собирающей протоки, кератиноцита в эпидермисе, парафолликулярной клетки в тироидных /C-клетках/, интестинальной клетки, трофобласта в плаценте, тромбоцита, васкулярной клетки гладкой мышцы, клетки сердечного предсердия, клетки, секретирующей гастрин и глюкагон, почечной мезангиальной клетки и клетки грудной железы.
В других предпочтительных вариантах молекула вызывает мобилизацию внутриклеточного Ca2+, вызывая увеличение /Ca2+/в, клетка является остеобластом или C-клеткой и молекула ингибирует резорбцию кости in vivo, клетка является остеокластом и молекула ингибирует костную резорбцию in vitro или клетка является C-клеткой и молекула стимулирует секрецию кальцитонина in vitro или in vivo, и наиболее предпочтительно молекула является кальцимиметической или кальцилитической, имеющей ЭК50 или ИК50 при Ca2+-рецепторе меньше или равную 5 М и даже более предпочтительно меньшую или равную 1 М, 100 нмолярную, 10 нмолярную или 1 нмолярную. Такие низкие ЭК50 или ИК50 являются выгодными, потому что они позволяют использовать более низкую концентрацию молекулы in vitro или in vivo для лечения или диагностики. Открытие молекул с такими низкими ЭК50 или ИК50 дает возможность конструировать и синтезировать подобным образом мощные и эффективные молекулы.
Под "кальцимиметической" молекулой понимают любую молекулу, которая обладает одной или более активностями внеклеточного Ca2+ и предпочтительно имитирует активность Ca2+ у рецептора Ca2+. Например, при использовании в отношении паратироидной клетки она является молекулой, которая при испытании на паратироидных клетках in vitro обладает одной или более, а предпочтительно всеми из последующих характеристик, как измерено с помощью методик, хорошо известных на данном уровне техники:
1. Молекула вызывает быстрое (время до пика < 5 с) и кратковременное увеличение /Ca2+/в, которое является невосприимчивым к ингибированию 1 М La3+ или Gd3+. Увеличение /Ca2+/в продолжает существовать в отсутствие внеклеточного Ca2+, но исчезает при предварительной обработке иономицином (в отсутствие внеклеточного Ca2+).
2. Молекула делает возможным увеличение /Ca2+/в, вызванное субмаксимальными концентрациями внеклеточного Ca2+.
3. Увеличение /Ca2+/в, вызванное внеклеточным Ca2+, не ингибируется дигидропиридинами.
4. Кратковременное увеличение /Ca2+/в, вызванное молекулой, снимается предварительной обработкой в течение 10 минут 10 мМ фторида натрия.
5. Кратковременное увеличение /Ca2+/в, вызванное молекулой, снижается предварительной обработкой активатором протеинкиназы C /ПКС/, таким как форболмиристатацетат /ФМА/, мезерейн или /-/-индолактам V. Суммарное действие активатора протеинкиназы C является сдвигом вправо кривой концентрация - ответ на молекулу без воздействия на максимальный ответ.
6. Молекула вызывает быстрое (< 30 с) увеличение образования инозитол-1,4,5-трифосфата или диацетилглицерина.
7. Молекула ингибирует образование допамин- или изопротеренолстимулированного циклического АМФ.
8. Молекула ингибирует секрецию ПТГ.
9. Предварительная обработка коклюшным токсином (100 нг/мл в течение > 4 часов) блокирует ингибирующее действие молекулы на образование циклического АМФ, но не оказывает влияния на увеличение /Ca2+/в, инозитол-1,4,5-трифосфата или диацетилглицерина, ни на снижение секреции ПТГ.
10. Молекула вызывает увеличение /Ca2+/в, как определяется, например, как увеличение потока Cl- в Xenopus ооцитах, инъецированных мРНК, обогащенной поли/A/+, из бычьих или человеческих паратироидных клеток, но не оказывает воздействия на Xenopus ооциты, инъецированные водой или мРНК мозга крысы или печени.
11. Подобным образом, используя клонированный рецептор из паратироидных клеток, молекула будет вызывать ответ в Xenopus ооцитах, инъецированных специфической кДНК, мРНК или синтетической смысловой РНК /кРНК/, кодирующей рецептор.
Под "кальцилитической" молекулой понимают любую молекулу, которая блокирует одну или более активностей внеклеточного Ca2+ на чувствительную к внеклеточному Ca2+ клетку, предпочтительно при действии в качестве антагониста на Ca2+-рецептор. Например, при использовании в отношении паратироидной клетки она является молекулой, которая при испытании на паратироидных клетках in vitro обладает одной или более, а предпочтительно всеми из следующих характеристик, как измерено с помощью методик, хорошо известных на данном уровне техники:
1. Молекула блокирует, частично или полностью, способность к увеличению концентраций внеклеточного Ca2+, чтобы:
а) увеличить /Ca2+/в,
б) мобилизовать внутриклеточный Ca2+,
в) увеличить образование инозитол-1,4,5-трифосфата,
г) снизить образование допамин- или изопротеренолстимулированного циклического АМФ, и
д) ингибировать секрецию ПТГ.
2. При низкой /Ca2+/, т.е. 0,5 мМ, молекула сама не изменяет /Ca2+/в.
3. Молекула блокирует увеличение потока Cl- в Xenopus ооцитах, инъецированных поли/A/+-мРНК из бычьих или человеческих паратироидных клеток, вызванного внеклеточным Ca2+ или кальцимиметическими соединениями, но не в Xenopus ооцитах, инъецированных водой или мРНК мозга крысы или печени/
4. Подобным образом при использовании клонированного рецептора из паратироидных клеток молекула будет блокировать ответ в Xenopus ооцитах, инъецированных специфической кДНК, мРНК или кДНК, кодирующей Ca2+-рецептор, вызванный внеклеточным Ca2+ или кальцимиметическим соединением.
Параллельные определения полезных кальцимиметиков и кальцилитиков на Ca2+-рецепторы на других типах клеток являются очевидными из приведенных ниже примеров.
Рецептор Ca2+ способен определить и ответить на некоторые неорганические поликатионы и поликатионные органические молекулы. Например, паратироидная клетка не способна различить увеличение концентрации внеклеточного Ca2+ из-за добавления этих органических поликатионов возможно потому, что эти органические молекулы действуют точно подобно внеклеточному Ca2+ у Ca2+-рецепторов. Кальцимиметические молекулы настоящего изобретения являются особенно хорошими агонистами Ca2+-рецептора и могут быть использованы в качестве лекарств, которые изменяют выбранные клеточные функции, например секрецию ПТГ из паратироидных клеток. В противоположность Ca2+ большинство этих молекул действует только на один или более, но не на все Ca2+-рецепторы и, следовательно, обеспечивают способность специфически воздействовать на один Ca2+-рецептор.
Эти молекулы также обеспечивают ведущие структуры для разработки дополнительных новых лекарств, эффективных для лечения различных заболеваний, где имеют значения /Ca2+/в и /Ca2+/, таких как гиперпаратироидизм, остеопороз, болезнь Пагета, гипертония, почечная болезнь, заболевание кожи, сердечно-сосудистое заболевание, расстройства свертывания крови, желудочно-кишечные заболевания, эндокринные заболевания, аномальности метаболизма воды и рак.
Кальцимиметики и кальцилитики могут быть сформулированы в виде фармацевтических композиций, которые являются полезными для регулирования уровня внеклеточного свободного Ca2+ у пациента и для мимикрирующего действия внеклеточного Ca2+ на клетку, выбранную в описанной выше группе, при введении пациенту такой фармацевтической композиции. До настоящего изобретения заявитель не знал о каких-либо таких молекулах, действующих на Ca2+-рецептор, полезных для лечения заболеваний, вызванных нерегулярностью в работе или регуляцией Ca2+-рецептора, или заболеваний у животных, имеющих нормальные Ca2+-рецепторы, но которые могут быть вылечены при активации или дезактивации таких Ca2+-рецепторов.
В еще одном предпочтительном варианте молекула имеет ЭК50, меньшую или равную 5 М для одной или более, но не для всех клеток, выбранных в группе, состоящей из паратироидных клеток, костных остеокластов, окологломерулярных почечных клеток, проксимальных почечных канальцевых клеток, периферических канальцевых почечных клеток, клеток толстой восходящей ветви петли Хенля и/или собирающей протоки, кератиноцита в эпидермисе, парафолликулярной клетки в щитовидной железе (C-клетки), интестинальной клетки, трофобласта в плаценте, тромбоцита, васкулярной клетки гладкой мышцы, клетки сердечного предсердия, клеток, секретирующих гастрин и глюкагон, почечной мезангиальной клетки и клетки грудной железы.
Специфичность действия таких молекул является тем, что особенно выгодно в настоящем изобретении, поскольку она обеспечивает специфическое лечение и диагностику in vivo и in vitro и открытие дополнительных кальцимиметических или кальцилитических молекул.
В специальных предпочтительных вариантах молекула является положительно заряженной при физиологическом pH и выбрана в группе, состоящей из разветвленных или циклических полиаминов, положительно заряженных полиаминокислот и аралкиламинов, например разветвленный полиамин имеет формулу H2N-/CH2/j -/NRi -/CH2/j /k-NH2, где k является целым числом от 1 до 10, каждый j является одинаковым или различным и представляет собой целое число от 2 до 20, а каждый Ri является одинаковым или различным и выбран в группе, состоящей из водорода и -/CH2/j -NH2, где j имеет указанные ранее значения, и по крайней мере один Ri не является водородом.
В альтернативном варианте молекула имеет формулу
где каждый X независимо выбран в группе, состоящей из H, CH3, CH3O, CH3CH2O, Br, Cl, F, CF3, CHF2, CH2F, CF3O, CH3S, OH, CH2OH, CONH2, CN, NO2 и CH3CH2, Ar является гидрофобным фрагментом, каждый R независимо выбран в группе, состоящей из водорода, метила, этила, пропила, изопропила, бутила, изобутила, циклопентила, циклогексила, циклогептила, циклооктила, инденила, инданила, дигидроиндолила, тиодигидроиндолила, 2-, 3- или 4-пиперид/ин/ила, Y выбран в группе, состоящей из CH, азота и ненасыщенного углерода, Z выбран в группе, состоящей из кислорода, азота, серы,
где каждый n независимо равен 1-4 включительно, а каждый m независимо равен 0-5 включительно. Наиболее предпочтительно молекула является кальцимиметической или кальцилитической.
В предпочтительных вариантах гидрофобный фрагмент выбран в группе, состоящей из фенила, 2-, 3- или 4-пиридила, 1- или 2-нафтила, 1- или 2-хинолила, 2- или 3-индолила, бензила и фенокси; молекула является производным R-фенилпропил--фенетиламина и молекула имеет формулу
где каждый X предпочтительно независимо выбран в группе, состоящей из Cl, F, CF3, CH3 и CH3O.
В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения новые аналоги и производные фенилпропил--фенетиламина имеют формулу
где alk является алкиленом с прямой или разветвленной цепью, содержащей 1-6 атомов углерода, R1 является низшим алкилом с 1-3 атомами углерода или низшим галоидалкилом с 1-3 атомами углерода, замещенным 1-7 атомами галоида, R2 и R3 являются независимо выбранными карбоциклическими арильными или циклоалкильными группами, или моноциклическими или бициклическими, имеющими 5- или 6-членные циклы, необязательно замещенные 1-5 заместителями, независимо выбранными среди низшего алкила с 1-3 атомами углерода, низшего галоидалкила с 1-3 атомами углерода, замещенного 1-7 атомами галоида, низшего алкокси с 1-3 атомами углерода, галоида, нитро, амино, алкиламино, амидо, низшего алкиламидо с 1-3 атомами углерода, циано, гидроксила, ацила с 2-4 атомами углерода, низшего оксиалкила с 1-3 атомами углерода или низшего тиоалкила с 1-3 атомами углерода. Подходящие карбоциклические арильные группы являются группами, имеющими одно или два кольца, по крайней мере одно из которых имеет ароматический характер, и включают карбоциклические арильные группы, такие как фенил, и бициклические арильные группы, такие как нафтил. Как видно из приведенной выше формулы, соединения, охватываемые ею, могут существовать в виде рацемических смесей и в виде индивидуальных изомеров. Особенно предпочтительными являются производные R-фенилпропил--фенетиламина, которые проявляют повышенную активность при понижении сывороточного ионизированного кальция.
Предпочтительные соединения включают те, у которых alk является н-пропиленом. Также предпочтительными являются соединения, у которых R1 является метилом. Также предпочтительными являются те соединения, у которых R2 и R3 являются необязательно замещенными фенилами.
Особенно предпочтительные соединения включают те, у которых R2 является монозамещенным фенилом, более предпочтительно метазамещенным. Особенно предпочтительные R3 группы включают незамещенный или монозамещенный фенил, особенно ортозамещенный. Предпочтительные заместители для R2 включают галогид, галоидалкил, предпочтительно тригалоидметил, и алкокси, предпочтительно метокси. Предпочтительные заместители для R3 включают галоид, предпочтительно хлор.
Во втором родственном аспекте изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего заболевание или состояние, характеризующееся аномальной /Ca2+/ или /Ca2+/в в одной или более клетках или в крови, или в плазме, или во внеклеточных жидкостях. Способ включает стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества молекулы, которая или имитирует активность внеклеточного Ca2+, вызывая повышение /Ca2+/в в клетке, или блокирует повышение /Ca2+/в, вызванное внеклеточным Ca2+.
Под "аномальным" понимают, что пациент по сравнению с общей популяцией имеет другой метаболизм Ca2+, который находится под воздействием одного или более белков /например, гормонов/ в крови или внеклеточных жидкостей организма, или других молекул, которые влияют на уровень внеклеточного и/или внутриклеточного Ca2+. Итак, заболевания включают гиперпаратироидизм, остеопороз и другие костные и минерально-зависимые болезни и т.п. (как описано, например, в стандартных медицинских справочниках, таких как "Harrison's Principles of Internal Medicine"). Такие заболевания лечат в настоящем изобретении молекулами, которые имитируют или блокируют один или несколько эффектов Ca2+ и в результате непосредственно или косвенно влияют на уровни белков или других молекул в организме пациента.
Под "терапевтически эффективным количеством" понимают количество, которое устраняет до некоторой степени один или более симптомов заболевания или состояния пациента. Дополнительно, под "терапевтически эффективным количеством" понимают количество, которое возвращает к нормальным, частично или полностью, физиологические или биохимические параметры, ассоциированные с или вызванные заболеванием или состоянием. Обычно это количество находится между примерно 1 нмолем и 1 молем молекулы, в зависимости от ее ЭК50 и возраста пациента, его размеров и заболевания.
В предпочтительных вариантах молекула имеет ЭК50 меньше или равную 5 М и она не является протамином; и наиболее предпочтительно взаимодействует с Ca2+-рецептором кальцимиметически или кальцилитически. Наиболее предпочтительно молекула выбрана среди одной из описанных выше.
В других предпочтительных вариантах пациент имеет заболевание, характеризующееся аномальным уровнем одного или более компонентов, уровень которых регулируется или находится под воздействием активности одного или более рецепторов Ca2+, и молекула является активной на Ca2+-рецепторе клетки, выбранной в группе, состоящей из паратироидных клеток, костных остеокластов, окологломерулярных почечных клеток, проксимальных почечных канальцевых клеток, периферических канальцевых почечных клеток, клеток толстой восходящей ветви петли Хенля и/или собирающей протоки, кератиноцита в эпидермисе, парафолликулярной клетки в тироиде (C-клетки), интестинальной клетки, трофобласта в плаценте, тромбоцита, васкулярной клетки гладкой мышцы, клетки сердечного предсердия, клеток секретирующих гастрин и глюкагон, почечной мезангиальной клетки и клетки грудной железы.
В других еще предпочтительных вариантах молекула снижает уровень паратироидного гормона в сыворотке пациента, например, до такого уровня, который имеется у нормального индивидуума, или до степени, достаточной, чтобы вызывать снижение Ca2+ в плазме, и молекула обеспечивается в количестве, достаточном для того, чтобы вызвать терапевтически нужный эффект у пациента.
В третьем аспекте изобретение относится к способу диагностики заболевания или состояния у пациента путем идентификации количества и/или места нахождения (и/или функциональной целостности) одного или более рецепторов Ca2+ в организме пациента и сравнения с тем количеством и/или местом нахождения (и/или функциональной целостностью), которые наблюдаются у нормальных пациентов как указания на наличие заболевания или состояния.
В предпочтительных вариантах способ является иммуноаналитическим, в котором используют антитело к рецептору Ca2+ для идентификации количества и/или места расположения и/или функциональной целостности Ca2+-рецепторов, или анализ включает обеспечение меченой кальцимиметической или кальцилитической молекулы, которая связывается с Ca2+-рецептором, и диагностируемым заболеванием является рак, например эктопическая опухоль паращитовидной железы, или состояние, характеризующееся уровнем выше нормального числа остеокластов в кости или повышенным уровнем активности остеокластов в кости.
В четвертом аспекте изобретение относится к способу идентификации молекулы, полезной в качестве терапевтической молекулы. Способ включает скрининг потенциально полезной молекулы или по ее способности имитировать активность внеклеточного Ca2+ в клетке, или блокировать повышение /Ca2+/в, вызванное внеклеточным Ca2+, и определение того, имеет ли молекула ЭК50 или ИК50 меньше или равную 5 М.
В других аспектах изобретение относится к рекомбинантному Ca2+-рецептору, к клетке, включающей рекомбинантный Ca2+-рецептор, очищенной нуклеиновой кислоте, кодирующей Ca2+-рецептор, биологической активности и применению молекулы NPS 019, новым соединениям или композициям с NPS 459, NPS 467 и NPS 568 (см. фиг. 36) и к способу идентификации молекулы, которая имитирует или блокирует одну или более активностей Ca2+ на первом Ca2+-рецепторе, но не на втором Ca2+-рецепторе, например, при использовании рекомбинантного Ca2+-рецептора.
В другом аспекте применяют клетку, включающую рекомбинантный Ca2+-рецептор/ы/ из почки, в качестве тест-системы для скрининга антибиотиков (например, аминогликозидных антибиотиков) на активность к кальциевым рецепторам, которые вызывают почечную токсичность у людей.
Термин "рекомбинантный" означает включение любого Ca2+-рецептора, полученного методиками рекомбинантной ДНК, так что он отличается от Ca2+-рецептора природного происхождения или местом его расположения, чистотой, или структурой. Обычно такой рецептор будет находиться в клетке в количестве, отличающемся от того, которое обычно наблюдается в природе.
Под "очищенным" понимают, что антитело или нуклеиновая кислота отличается от антитела или нуклеиновой кислоты природного происхождения, являясь отделенными от антитела или нуклеионовой кислоты, с которыми они встречаются в природе, например в векторной системе, так что они могут быть использованы для экспрессии рекомбинантного Ca2+-рецептора. Предпочтительно антитело или нуклеиновая кислота поставляются в виде однородного препарата по стандартным методикам.
Такие клонированные рецепторы могут быть экспрессированы в желаемой клетке и выделены и кристаллизованы, чтобы можно было провести определение структуры. Такая структура даст возможность сконструировать полезные молекулы настоящего изобретения, которые могут связываться с Ca2+-рецептором. Кроме того, эквивалент таких рецепторов может быть клонирован с использованием первого клона в качестве зонда для клонов в другой клетке, кДНК или геномных библиотек.
Антитела к клонированному рецептору могут быть изолированы и использованы в качестве лекарственных средств в настоящем изобретении, или в качестве диагностических инструментов для определения количества Ca2+-рецепторов, и/или мест расположения, и/или функциональной целостности для диагностики Ca2+-вызванных заболеваний или состояний. Такие антитела также могут быть использованы in vivo путем внутреннего введения в качестве кальцимиметиков или кальцилитиков.
Итак, в общем, изобретение относится к кальцимиметическим или кальцилитическим молекулам, способным действовать или как селективные агонисты, или антагонисты по отношению к Ca2+-рецептору одной или более, но не всех клеток, выбранных в группе, состоящей из паратироидных клеток, костных остеокластов, окологломерулярных почечных клеток, проксимальных почечных канальцевых клеток, периферических канальцевых почечных клеток, клеток толстой восходящей ветви петли Хенля и/или собирающей протоки, кератиноцита в эпидермисе, парафолликулярной клетки в тироиде (C-клеток), интестинальной клетки, трофобласта в плаценте, тромбоцита, васкулярной клетки гладкой мышцы, клетки сердечного предсердия, клеток, секретирущих гастрин и глюкагон, почечной мезангиальной клетки и клетки грудной железы. Такая композиция может включать любой фармацевтически приемлемый носитель, известный на данном уровне техники, для обеспечения фармацевтической композиции.
Изобретение также относится к модуляции ряда Ca2+-рецепторов у пациента по стандартным методикам, например антисмысловой, и родственным технологиям (например, рибозимы), в качестве терапевтического средства для состояния болезни.
Настоящее изобретение обеспечивает способы идентификации молекул, которые влияют на активность Ca2+-рецептора, используя анализ, как определено ниже, для определения кальцимиметиков и/или кальцилитиков. Кроме того, молекулы, найденные эффективными для снижения или повышения экспрессии Ca2+-рецептора на транскрипционном или трансляционном уровне при использовании анализа, или антител, или других методик, описанных выше, могут быть определены для терапевтических применений.
Приведенное выше краткое изложение было сделано в значительной степени в связи с предпочтительным вариантом, который относится в общем к кальциевым рецепторам. В другом аспекте изобретение относится к новому суперсемейству полипептидных рецептор/сенсорных молекул. Клон кДНК, BoPCaR I, описанный здесь и должным образом депонированный, представляет собой первый такой клон, описанный для кодирования рецептора/сенсора, который является членом этого суперсемейства. Для целей настоящего изобретения рецепторы/сенсоры, принадлежащие к этому суперсемейству, называют рецепторами неорганических ионов.
Новое суперсемейство рецепторов неорганических ионов включает множество таких молекул, которые связаны друг с другом подобием аминокислотной последовательности, структурой и/или функцией. В общем эти признаки также отличают членов этого суперсемейства рецепторов от всех рецепторов/сенсоров, известных в настоящее время на данном уровне техники. Члены этого суперсемейства рецепторов в первую очередь отличаются функционально по их неожиданной способности определять и отвечать на изменения уровней неорганических катионов, таких как кальций, магний, калий, натрий или ионы водорода и т.п., и при ощущении таких ионов вызывать изменения в клеточных функциях. Такие изменения могут включать изменения на уровнях вторичного мессенджера, как это происходит с известным G-белком, связанным с рецепторами, или изменения ионного потока через мембрану, или т.п. Также существуют другие члены этого суперсемейства, которые ощущают неорганические анионы, такие как ионы фосфата или хлорида. Все такие рецепторы входят в область настоящего изобретения, как оно здесь описано. Дополнительно все выделенные лиганды природного происхождения или синтетические для рецепторов/сенсоров, принадлежащих к суперсемейству рецепторов неорганических ионов, входят в область настоящего изобретения. В дополнительном аспекте изобретение относится к терапевтическому применению любых таких природных или синтетических лигандов для рецепторов неорганических ионов.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является то, что рецепторы, принадлежащие к суперсемейству рецепторов
неорганических ионов, могут быть активированы возбудителем, другим, чем связывание лиганда. Например, некоторые члены этого суперсемейства рецепторов активируются физическими силами, такими как силы растяжения, действующие на мембраны клеток, экспрессирующих такие рецепторы. Все такие рецепторы входят в область настоящего изобретения.
Рецепторы неорганических ионов могут быть использованы таким образом, как описано выше в связи с предпочтительным рецептором. Рекомбинантные рецепторы, экспрессированные в разнообразных типах тканей, включая человеческие типы тканей, могут быть использованы для скрининга (включая скрининг с большим количеством материала, израсходованного за определенный срок) для открытия лекарств способами, известными специалистам в данной области. Ионмиметики и ионлитики могут быть легко идентифицированы. Процедуры могут быть приспособлены для индивидуальной функции рецептора. Например, может быть применен активированный кальцием поток хлорида с рецептором неорганического иона, который образует кальциевый канал или который питается (nutrilises) внутриклеточным кальцием. Лигандпропускающие ионные каналы известны на данном уровне техники. Рецепторы неорганических ионов, которые соединены с вторичными мессенджерными системами, позволяют проводить анализ, как описано выше, включая измерение циклического АМФ и инозитолфосфатов. Клетки, которые имеют рекомбинантные рецепторы, связанные с легко детектируемыми агентами, также могут быть использованы, такие как G-белковые сочетания рецепторов с дисперсией пигмента в меланофорах, как описано в литературе. Следовательно, изобретение полностью дает способы обнаружения агентов, которые являются миметиками или литиками рецепторов неорганических ионов, а также самих таких миметиков и литиков, включая те, что предпочтительно выбраны из миметиков и литиков, детально описанных выше. Подобным образом изобретение охватывает диагностику и лечение болезней и состояний, относящихся к рецепторам неорганических ионов, как описано выше в связи с предпочтительным вариантом. Например, заболевания, ассоциированные с повышенными уровнями рецептора неорганических ионов, могут быть диагностированы на основании анализа таких повышенных уровней. Терапевтические молекулы могут быть идентифицированы путем скрининга агентов, которые имитируют активность относящегося к проблеме нативного иона или которые модифицируют действие или мощность имеющего отношение к делу нативного иона. Экспрессия специфической ткани, а также уровни экспрессии могут быть оценены и т.п.
Итак, в настоящем аспекте изобретения обеспечивается новое суперсемейство изолированных рецепторов неорганических ионов и также обеспечиваются их единичные фрагменты. Предпочтительно изолированные рецепторы являются человеческими рецепторами, а наиболее предпочтительно изолированный рецептор является кальциевым рецептором, экспрессированным в тканях или клетках, выбранных в группе, состоящей из паращитовидной железы, сосудистой, почечной ткани, эпидермиса, щитовидной железы, остеокласта, кишечника, грудной железы, трофобласта, тромбоцита, секретирующей гастрин, секретирующей глюкагон, сердечной и мозговой, и их единичных фрагментов. Изобретение, кроме того, относится к полипептидным фрагментам вышеупомянутых рецепторов неорганических ионов, которые обладают желаемой активностью. Например, фрагмент может включать точное место связывания или центр, которые связываются с миметиками, агонистами или антагонистами. Другие полезные фрагменты включают те, которые имеют только наружную часть, охватывающие мембрану участки или внутриклеточную часть рецептора. Кроме того, фрагменты являются полезными для образования химерных рецепторов с фрагментами других рецепторов, как более детально описано ниже. Изобретение также относится к мутантам или аналогам и другим производным изолированных рецепторов. Так, изобретение охватывает не только белки природного происхождения, но и их производные.
Изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, кодирующим вышеупомянутые рецепторы неорганических ионов и их фрагменты и производные. Такие нуклеотидные последовательности могут быть получены с помощью разнообразных процедур и описание настоящего изобретения позволяет специалисту в данной области получить кДНК или геномные клоны, кодирующие такие рецепторы. Например, могут быть приготовлены зонды гибридизации на основе нуклеотидной последовательности BoPCaR I. Когда геномные библиотеки для кДНК библиотек из любой ткани скринируют при низкой убедительности таких зондов, получают гибридизирующие клоны, которые кодируют другие члены суперсемейства. Дополнительно, могут быть легко получены антитела, которые связываются с клонированными или изолированными рецепторами неорганических ионов. Такие антитела также могут быть использованы для выделения других рецепторов изобретения по методикам экспрессия-клонирование, известным специалистам в данной области. Также может быть применена "прогулка" гена-мишени для идентификации и клонирования членов суперсемейства рецепторов неорганических ионов. Дополнительно клоны могут быть получены с помощью процедур экспрессии-клонирования, как описано выше. Эти процедуры могут быть адаптированы для индивидуальной функции интересующего рецептора неорганического иона. Например, также могут быть применены потоки хлорида, активированные кальцием, для клонирования рецептора неорганического иона, который образует кальциевый канал или который мобилизует внутриклеточный кальций. Лигандоткрытые ионные каналы, как описано выше, известны на данном уровне техники. Например, серотониноткрытый ионный канал был клонирован таким образом. Однако рецепторы настоящего изобретения отличаются от других известных лигандоткрытых ионных каналов по своим аминокислотным последовательностям и тем, что они чувствуют такие неорганические ионы, как кальций, магний, ионы водорода, ионы фосфата и т.п.
Также специалисту в данной области следует учитывать, что каждый клонированный рецептор, полученный таким образом, обеспечивает такие новые зонды ДНК или антител, которые сами используются для идентификации еще дополнительных клонов, кодирующих рецепторы неорганических ионов. Кроме того, следует учитывать, что получив последовательность более чем одного такого рецептора, как подчеркнуто выше, становится доступной информация, имеющая отношение к сохранению локализованной последовательности, которая является полезной для получения еще дополнительных клонов, кодирующих другие члены этого суперсемейства. Такие сохраненные последовательности также могут происходить из анализа общей структуры BoPCaR I, так как она обычно включает внеклеточную область, трансмембранную область и внутриклеточную область.
Итак, обеспечиваются изолированные нуклеиновые кислоты, кодирующие рецепторы неорганических ионов и их единичные фрагменты. Предпочтительным рецептором является кальциевый рецептор, который экспрессируется в тканях или клетках, выбранных в группе, описанной выше. Наиболее предпочтительно нуклеиновая кислота кодирует человеческий рецептор неорганического иона или его единичный фрагмент. Изобретение, кроме того, обеспечивает выделение эндогенных регуляторных элементов, контролирующих экспрессию вышеупомянутых рецепторов неорганических ионов, и агенты, которые способны агонизировать или антагонизировать активность этих регуляторных элементов, также могут быть идентифицированы.
Изобретение, кроме того, обеспечивает рекомбинантные клетки, экспрессирующие нуклеиновые кислоты изобретения. В таких клетках нуклеиновая кислота может быть под контролем ее геномных регуляторных элементов или может быть под контролем экзогенных регуляторных элементов, включающих экзогенный промотор. Под термином "экзогенный" понимают промотор, который обычно не связан in vivo транскрипционно с кодирующей последовательностью для рецептора неорганических ионов.
Обеспечиваются антитела к вышеуказанным рецепторам неорганических ионов, а также антитела к аллостерическим участкам таких рецепторов и идиотипы таких рецепторов.
Также обеспечиваются агенты, связывающие рецептор неорганических ионов, соединенные с токсином. Такие агенты могут быть антителами и как таковые являются иммунотоксинами. Такие иммунотоксины могут быть полезными, например, для уничтожения клетки, экспрессирующей рецептор неорганического иона, in vitro или in vivo.
В дополнение к этому изобретение обеспечивает трансгенных нечеловеческих млекопитающих, содержащих трансген, кодирующий рецептор неорганического иона или его единичный фрагмент. Такие трансгены могут быть полезными для воздействия или изменения экспрессии рецептора неорганического иона или инактивации экспрессии рецептора неорганического иона, например, через гомологическую рекомбинацию. Другие трансгены могут быть обеспечены в таких млекопитающих, включая трансгены, кодирующих антисмысл или белок, который способен изменить экспрессию нативного гена рецептора неорганических ионов. Такое изменение может быть сверхрегуляцией, понижающей регуляцией или полной инактивацией.
Так, обеспечиваются способы, включающие контактирование клетки с агентом, который связывается с клеточным компонентом с целью воздействия на экспрессию рецептора неорганического иона. Такие агенты могут связываться с промоторами, другими регуляторными агентами, действующими на промоторы, агенты, способные к связыванию с рецептором, и нуклеиновыми кислотами, кодирующими рецептор или его единичный фрагмент. Контактирование может быть путем внеклеточного введения, путем обеспечения трансгена, кодирующего агент, или любым другим подходящим методом в зависимости от применения, для которого предназначен конкретный способ.
Другие признаки и преимущества изобретения будут видны из последующего описания его предпочтительных вариантов и из формулы изобретения.
Описание предпочтительных вариантов
На фиг. 1 представлены типичные молекулы, полезные в изобретении.
На фиг. 2 приведен график, показывающий увеличение /Ca2+/в, вызванное внеклеточным Ca2+ в quin-2- или fura-2-нагруженных бычьих паратироидных клетках. Исходная /Ca2+/ составляла 0,5 мМ (с использованием CaCl2) и на каждой стрелке увеличивалась с инкрементами 0,5 мМ.
На фиг. 3 приведен график, показывающий мобилизацию /Ca2+/в в бычьих паратироидных клетках. Исходная /Ca2+/ составляет 0,5 мМ и понижается до < 1 М при добавлении EGTA, как указано. /а/ Внеклеточный Mg2+ (8 мМ, конечная) вызывает увеличение /Ca2+/в в отсутствие внеклеточного Ca2+. /б/ Предварительная обработка иономицином /1 М/ блокирует ответ на Mg2+. /в/ Предварительная обработка 5 М молекулы 1799 (митохондриальный разобщитель) не оказывает действия на ответ на Mg2+.
На фиг. 4 представлен график, показывающий предпочтительные ингибирующие воздействия низкой концентрации Gd3+ на стационарное увеличение /Ca2+/в и что высокая концентрация Gd3+ вызывает кратковременное повышение /Ca2+/в в бычьих паратироидных клетках. Верхняя картинка: контроль; исходная концентрация внеклеточного Ca2+ составляет 0,5 мМ и увеличивается на 0,5 мМ на каждом острие стрелки. Средняя картинка: Gd3+ (5 мМ) блокирует стационарное состояние, но не кратковременное повышение /Ca2+/в, вызванное внеклеточным Ca2+. Нижняя картинка: Gd3+ /50 мМ/ вызывает кратковременное повышение /Ca2+/в и снимает как кратковременный, так и продолжительный ответы на внеклеточный Ca2+. На средней и нижней картинках было добавлено точно достаточное количество EGTA, чтобы хелатировать предпочтительно Gd3+: удаляется блок притока Ca2+ и резко возрастает /Ca2+/в.
На фиг. 5 представлен график, показывающий, что воздействия ФМА на /Ca2+/в, образование ИФ3 и секреция ПТГ устраняются при увеличении концентраций внеклеточного Ca2+ в бычьих паратироидных клетках. Для каждого варианта имеется сдвиг на кривой концентрация - ответ для внеклеточного Ca2+. Также отмечается, что кривые концентрация - ответ варьируют сигмоидально при линейном увеличении /Ca2+/.
На фиг. 6 приведен график, показывающий, что увеличение /Ca2+/в, вызванное спермином, прогрессивно снижается при увеличении /Ca2+/ в бычьих паратироидных клетках. Спермин /200 М/ прибавляют во время, указанное острием стрелки. На этом и на всех последующих чертежах числа, приведенные на чертеже, представляют собой /Ca2+/в в нМ.
На фиг. 7 представлен график, показывающий, что спермин мобилизует внутриклеточный Ca2+ в бычьих паратироидных клетках. EGTA прибавляют для снижения /Ca2+/ до < 1 перед добавлением спермина /200 М/, как указано (слева на чертеже). Предварительная обработка иономицином /1 М/ блокирует ответ на спермин (справа на чертеже).
На фиг. 8а и 8б приведены графики, показывающие, что спермин повышает /Ca2+/в и ингибирует секрецию ПТГ в бычьих паратироидных клетках подобно внеклеточному Ca2+. Данные для дозы спермина на кривых концентрация - ответ являются средними из двух экспериментов.
На фиг. 9 представлен график, показывающий контрастирующие эффекты ФМА на ответы на внеклеточный Ca2+ и на ответы на АТФs в бычьих паратироидных клетках. Левая картинка: кривая концентрация - ответ для ингибирования, вызванного внеклеточным Ca2+, образования циклического АМФ сдвинута вправо с помощью ФМА /100 нМ/. Средняя картинка: ФМА не влияет на способность АТФs увеличивать /Ca2+/в. Отметим также, что кривая концентрация - ответ для АТФs показывает классический сигмоидальный характер как функция Log концентрации в противоположность внеклеточным двухвалентным катионам.
На фиг. 10 приведен график, показывающий мобилизацию внутриклеточного Ca2+ в человеческих паратироидных клетках, вызванную внеклеточным Mg2+. Клетки были получены из аденомы и выдержаны в ванне из буфера, содержащего 0,5 мМ внеклеточного Ca2+. /а/ Кратковременное и продолжительное повышения /Ca2+/в, вызванные внеклеточным Mg2+ /10 мМ, конечная/, показывают, что на продолжительное увеличение не влияет нимодипин /1 М/, но понижается La3+ /1 М/ и быстро возвращается, когда La3+ селективно хелатируют низкими концентрациями EGTA. /б/ La3+ /1 М/ блокирует продолжительное, но не кратковременное повышение /Ca2+/в, вызванное внеклеточным Mg2+. /в/ Цитозольный Ca2+, кратковременно вызванный внеклеточным Mg2+, существует в отсутствие внеклеточного Ca2+.
На фиг. 11 представлен график, показывающий мобилизацию внутриклеточного Ca2+, вызванную неомицином или протамином, в бычьих паратироидных клетках. На всех чертежах исходная /Ca2+/ и /Mg2+/ составляет 0,5 и 1 мМ соответственно. На фиг. 11 /а/ и /б/ концентрации Ca2+ и Mg2+ увеличены до 2 и 8 мМ от 0,5 и 1 мМ соответственно. На фиг. 11 /в/ - /и/ прибавляли неомицин B /30 \М/ или протамин /1 г/мл/, как указано. Прибавляют La3+ /1 М/, EGTA /1 мМ/ или иономицин /100 нМ/, как указано. Каждый чертеж является отражением опыта из 5 или более испытаний с использованием по крайней мере 3 различных клеточных препаратов. Bar = 1 мин.
На фиг. 12 представлен график, показывающий, что неомицин B блокирует кратковременное, но не блокирует стационарное увеличение /Ca2+/в, вызванное внеклеточным Ca2+ в бычьих паратироидных клетках. Слева контроль: /Ca2+/ сначала равна 0,5 мМ и увеличивается с инкрементами 0,5 мМ у каждой открытой стрелки перед добавлением неомицина B /30 М/. Справа: прибавляют неомицин B /30 М/ перед /Ca2+/. Bar = 1 мин.
На фиг. 13 представлен график, показывающий, что неомицин B или протамин ингибируют секрецию ПТГ при концентрациях, которые вызывают увеличение /Ca2+/в в бычьих паратироидных клетках. Клетки инкубировали при указанных концентрациях органического поликатиона в течение 30 минут в присутствии 0,5 мМ внеклеточного Ca2+. Открытые символы: контрольные ответы по секреции ПТГ в присутствии 0,5 (кружочки) или 2 мМ (ромбики) внеклеточного Ca2+. Величины для /Ca2+/в являются ромбовидными символами. В экспериментах с протамином использовали бычьи клетки, а в экспериментах с неомицином B использовали человеческие (аденома) паратироидные клетки. Каждая точка является средним SEM из 3 экспериментов.
На фиг. 14 представлены графические данные, показывающие предпочтительные ингибирующие эффекты ФМА кратковременные изменения цитозольного Ca2+, вызванные спермином в бычьих паратироидных клетках. Исходная /Ca2+/ равна 0,5 мМ, прибавляли спермин /200 М/ или АТФ /50 М/, как указано. Bar = 1 мин.
На фиг. 15 представлены графически результаты, показывающие, что ФМА сдвигает вправо кривые концентрация - ответ для индуцированного внеклеточным Ca2+ и неомицином B увеличения /Ca2+/в в бычьих паратироидных клетках. Клетки предварительно обрабатывали ФМА в течение 1 мин перед повышением /Ca2+/ или перед добавлением неомицина B, как указано. Каждая точка является средним SEM из 3-5 экспериментов.
На фиг. 16 представлены графически результаты, показывающие, что ФМА сдвигает вправо кривые концентрация - ответ для индуцированного внеклеточным Ca2+ и спермином ингибирования секреции ПТГ в бычьих паратироидных клетках. Клетки инкубировали с указанной /Ca2+/ и спермином в течение 30 минут в присутствии (зачерненные кружочки) и в отсутствие (открытые кружочки) 100 нМ ФМА. Каждая точка является средним SEM из 3 экспериментов.
На фиг. 17 представлены графически результаты, показывающие, что протамин повышает образование инозитолфосфатов в бычьих паратироидных клетках. Паратироидные клетки инкубировали всю ночь в культуральной среде, содержащей 4 Кю/мл 3H-мио-инозитола, промыли и инкубировали при указанной концентрации протамина при 37oC. После 30 с реакцию прекращали добавлением CHCl3:MeOH:HCl и ИФ1 (кружочки) и ИФ3 (треугольники) разделяли анионообменной хроматографией. Каждая точка является средним из 2 экспериментов, каждый выполнен в трех повторностях.
На фиг. 18 представлены графически результаты, показывающие, что ФМА снижает образование ИФ1, вызванное внеклеточным Ca2+ или спермином в бычьих паратироидных клетках. Меченые 3H-мио-инозитолом клетки экспонировали при указанной /Ca2+/ или спермина в течение 30 секунд перед прекращением реакции и определением ИФ1 анионообменной хроматографией. Hatched колонки: клетки предварительно обрабатывали ФМА /100 нМ/ в течение 5 минут перед повышением /Ca2+/ или добавлением спермина. Каждая величина является средней из 2 экспериментов, каждый осуществлен троекратно.
На фиг. 19 представлены графически результаты, показывающие кратковременное и продолжительное повышения /Ca2+/в, вызванные неомицином B в человеческих (аденома) паратироидных клетках. /Ca2+/ равна 0,5 мМ. /а/ Продолжительное повышение /Ca2+/в, вызванное неомицином B /10 М/, понижается La3+. /б/ Кратковременное повышение /Ca2+/, вызванное неомицином B, не подвергается влиянию La3+. /в/ Кратковременное повышение /Ca2+/в существует в отсутствие внеклеточного Ca2+.
На фиг. 20 представлены графически результаты, показывающие, что неомицин B вызывает колеблющееся повышение потока Cl- в Xenopus ооцитах, экспрессирующих Ca2+-рецептор. Верхний чертеж для ооцита три дня спустя после инъекции поли/A/+-мРНК человеческой (гиперпластичной) паратироидной клетки. Нижний чертеж для ооцита, инъецированного водой. Неомицину B не удалось вызвать ответ в пяти инъецированных водой ооцитах, а карбахол вызвал ответ в одной, что показано. На обоих чертежах удерживающий потенциал составляет -76 мВ.
На фиг. 21 представлены графически результаты, показывающие, что неомицину B не удалось оказать основное воздействие или вызвать увеличение в C-клетках. Контроль, левый чертеж: fura-2-нагруженные гМТС 6-23 клетки сначала промывали в буфере, содержащем 1 мМ Ca2+ перед повышением /Ca2+/ до 3 мМ. Правый чертеж: предварительная обработка 5 мМ неомицина B.
На фиг. 22 представлены графически результаты, показывающие, что внеклеточный Ca2+ вызывает увеличение /Ca2+/в в остеокластах крыс. Микрофлуориметрическая регистрация в единственном остеокласте крысы, нагруженном indo-1 и суперслитом в течение указанного времени с буфером, содержащим указанную /Ca2+/. Нормальный буфер, суперслитый между полосами, содержал 1 мМ Ca2+.
На фиг. 23 представлены графически результаты, показывающие, что спермин или неомицин B не смогли вызвать увеличение /Ca2+/в в остеокластах крыс. indo-1-нагруженный остеокласт был суперслит с указанной концентрацией спермина или неомицина B (пустые полоски) один или вместе с 20 мМ Ca2+ (темные полоски).
На фиг. 24 представлены графически результаты, показывающие различное действие аргиотоксина (показанного как аргиопин на чертеже, структуры также показаны на фиг. 1) 659 и аргиотоксина 636 на /Ca2+/в в бычих паратироидных клетках. Исходная /Ca2+/ равна 0,5 мМ и была повышена до 1,5 мМ, где указано (правый чертеж) N. Где указано, прибавляли аргиотоксин 659 /300 М/ или аргиотоксин 636 /400 М/.
На фиг. 25 представлены графически результаты, показывающие, что внеклеточный Mg2+ или Gd3+ вызывают колеблющееся увеличение потока Cl- в Xenopus ооцитах, инъецированных поли/A/+-мРНК бычьей паратироидной клетки. На чертеже /а/ концентрация внеклеточного Ca2+ составила < 1 М, а на чертеже /б/ 0,7 мМ. Чертеж /в/ показывает, что внеклеточный Mg2+ не смог вызвать ответ в ооцитах, инъецированных только мРНК для рецептора вещества K, хотя суперслияние с веществом K вызывает ответ. Удерживающий потенциал составил от -70 до -80 мВ.
На фиг. 26 представлены графически результаты, показывающие, что внеклеточный Ca2+ вызывает колеблющееся повышение потока Cl- в Xenopus ооцитах, инъецированных поли/A/+-мРНК человеческой (гиперпластичной) паратироидной ткани. Ооцит был испытан на отвечаемость на внеклеточный Ca2+ через три дня после инъекции 50 нг поли/A/+-мРНК. Удерживающий потенциал составил -80 мВ.
На фиг. 27 представлены графически результаты, показывающие мобилизацию внутриклеточного Ca2+ в бычьих паратироидных клетках, вызванную будмунхиамином. Будмунхиамин /300 М, структура показана выше/ был добавлен, где указано.
На фиг. 28 представлены графически результаты, показывающие, что способность к мобилизации внутриклеточного Ca2+ в паратироидных клетках является стреоспецифической. Бычьи паратиродиные клетки, нагруженные fura-2, сначала были суспендированы в буфере, содержащем 0,5 мМ внеклеточного Ca2+, перед добавлением указанной концентрации каждой молекулы.
На фиг. 29 представлены графически результаты, показывающие влияние La3+ на /Ca2+/в в остеокластах. Показан типичный график для единственного остеокласта крысы, нагруженного indo-1. При низких концентрациях La3+ частично блокирует повышение /Ca2+/в, вызванное внеклеточным Ca2+.
На фиг. 30а и 30б представлены графически результаты, показывающие мобилизацию внутриклеточного Ca2+, вызванную внеклеточным Mn2+, в остеокласте крысы. Внеклеточный Mn2+ вызывает зависящее от концентрации повышение /Ca2+/в (фиг. 30а), которое существует в отсутствие внеклеточного Ca2+ (фиг. 30б).
На фиг. 31а и 31б графически представлены результаты, показывающие мобилизацию /Ca2+/в в остеокласте крысы, вызванную молекулой NPS 449 (см. фиг. 38). Изолированные остеокласты крысы, нагруженные indo-1, подвергают суперслиянию с указанными концентрациями MPS 449 в присутствии (фиг. 31а) или в отсутствие /фиг. 31б/ 1 мМ внеклеточного CaCl2.
На фиг. 32 графически представлены результаты, показывающие мобилизацию внутриклеточного Ca2+ в C-клетках, вызванную NPS 019 (см. фиг. 1). гМТС 6-23 клетки были нагружены fura-2 и промыты в буфере, содержащем 0,5 мМ /Ca2+/. Где указано, прибавляют NPS 019 до конечной концентрации 10 М. Типичные чертежи показывают, что кратковременное повышение /Ca2+/в, вызванное NPS 019, является неподдающимся ингибированию La3+ (средний чертеж) и существует в отсутствие внеклеточного Ca2+ (правый чертеж).
На фиг. 33 графически представлены результаты, показывающие, что NPS 456 (фиг. 36) вызывает колеблющееся повышение потока Cl- в Xenopus ооцитах, которые были инъецированы поли/A/+-мРНК бычьей паратироидной клетки.
На фиг. 34 графически представлены результаты, показывающие, что внеклеточный Ca2+ вызывает колеблющееся повышение потока Cl- в Xenopus ооцитах, которые были инъецированы мРНК человеческого отсетокласта. Ооцит был испытан на отвечаемость на внеклеточный Ca2+ через три дня после инъекции 50 нг суммарной поли/A/+-мРНК.
На фиг. 35 графически представлены результаты, показывающие, что Ca2+-рецептор паратироидной клетки кодируется мРНК в интервале 2,5-3,5 kb поли/A/+-мРНК бычьей паратироидной клетки фракционировали по размеру в градиентах глицерина и собрали десять фракций. Каждую фракцию инъецировали /50 нг/ фракцию// отдельно в Xenopus ооциты. Через три дня исследовали ооциты на их способность отвечать на неомицин B /10 М/ с колеблющимся повышением потока Cl-.
На фиг. 36 показана химическая структура молекул, происходящих из дифенилпропил--фенетиламина, иллюстрирующая семейство молекул, которые были получены и скринированы для нахождения полезных молекул изобретения.
На фиг. 37 приведены графически результаты, показывающие что NPS 021 является кальцилитическим соединением, которое блокирует влияние внеклеточного Ca2+ на /Ca2+/в в бычьих паратироидных клетках. Клетки сначала промывают буфером, содержащим 0,5 мМ CaCl2, и, где указано, повышают /Ca2+/ до конечной концентрации 2 мМ (левый чертеж). Добавление NPS 021 /200 М/ не вызывает изменения /Ca2+/в, но ингибирует увеличение /Ca2+/в, вызванное внеклеточным Ca2+ (правый чертеж).
На фиг. 38 приведен график, показывающий ответ Ca2+ in vivo на NPS R, S-467.
На фиг. 39 приведен график, показывающий ответ ПТГ in vivo на NPS R, S-467.
На фиг. 40 приведен график, показывающий ответ сывороточного Ca2+ in vivo на 25 мг/кг NPS R, S-467.
На фиг. 41 приведен график, показывающий ответ /Ca2+/в in vivo в бычьих паратироидных клетках на различные энантиомеры NPS 467.
На фиг. 42 приведен график, показывающий ответ сывороточного Ca2+ in vivo у крыс на различные энантиомеры NPS 467.
На фиг. 43а приведена реакционная схема получения фендилина или аналогов фендилина или производных, приведенных на фиг. 36. На фиг. 43б приведена реакционная схема синтеза NPS 467.
На фиг. 44 приведена кривая доза - ответ, показывающая, что NPS 467 снижает сывороточный ионизированный кальций у крыс при оральном введении.
На фиг. 45 приведена рестрикционная карта плазмиды, содержащей BoPCaR I, депонированной в АТСС под номером хранения АТСС 75416.
На фиг. 46 приведена рестрикционная карта BoPCaR I.
На фиг. 47 приведена нуклеотидная последовательность (примерно 90% точности) фрагмента 2,2 Ко секвенированной BoPCaR I.
Кальцимиметические и кальцилитические молекулы
Кальцимиметические и кальцилитические молекулы, полезные в изобретении, в общем описаны ниже. Эти молекулы могут быть легко идентифицированы с использованием скрининговых процедур для определения молекул, которые имитируют или антагонизируют активность Ca2+ у Ca2+-рецепторов. Примеры таких процедур приведены ниже. Эти примеры не являются ограничивающими изобретение, но только иллюстрируют способы, которые легко использовать или модифицировать специалисту в данной области.
Обычно кальцимиметические и кальцилитические молекулы идентифицируют путем скрининга молекул, которые созданы по образцу описанных ниже (называемых ведущими молекулами). Как можно видеть из приведенного ниже, имеется несколько специфических кальцимиметиков и кальцилитиков, полезных у различных Ca2+-рецепторов. Производные молекулы легко конструируются по стандартным процедурам и испытываются по одному из многих протоков, известных специалистам в данной области. Может быть легко отобрано много молекул, чтобы идентифицировать наиболее полезную в настоящем изобретении.
Органические катионные молекулы, которые имитируют или антагонизируют действия Ca2+ в других системах, имеют структуру, требующуюся для активности на Ca2+-рецепторе. Рациональная схема для других полезных молекул включает изучение молекулы, про которую известно, что она является кальцимиметиком или кальцилитиком, а затем модификацию структуры известной молекулы. Например, полиамины являются потенциальными кальцимиметиками, поскольку спермин имитирует действие Ca2+ в нескольких системах in vitro. Результаты показывают, что спермин на самом деле вызывает изменения /Ca2+/в, а секреция ПТГ напоминает секрецию, вызванную внеклеточными двух- и трехвалентными катионами (см. ниже). Наоборот, Ga3+ противодействует влиянию Gd3+ на рецептор/ы/ кальция бычьего паратироида. Следовательно, приведенные ниже эксперименты позволяют показать, что такая феноменология, полученная со спермином, включает одинаковые механизмы, используемые внеклеточным Ca2+. При этом оцениваются воздействия спермина на различные физиологические и биохимические параметры, которые характеризуют активацию Ca2+-рецептора. Молекулы, обладающие подобными воздействия, являются полезными в настоящем изобретении и могут быть обнаружены путем отбора или получения молекул, имеющих структуру, подобную спермину. Как только обнаружена другая полезная молекула, этот процесс отбора может быть легко повторен.
Для ясности ниже приводится определенная серия протоколов скрининга для идентификации таких полезных молекул, которые являются активными у Ca2+-рецептора паратироидной клетки, или которые действуют как агонисты или антагонисты клеточного ответа на изменения /Ca2+/. Эквивалентный анализ может быть использован для молекул, активных у других Ca2+-рецепторов или других рецепторов неорганических ионов, или которые, иначе, имитируют или антагонизируют клеточные функции, регулируемые /Ca2+/ или другими ионами. Эти анализы являются примерами процедур, которые полезны для обнаружения молекул, включая кальцимиметические молекулы, настоящего изобретения. Эквивалентные процедуры могут быть использованы для обнаружения литических молекул, включая кальцилитические молекулы, путем скрининга таких молекул по наибольшему антагонизму действия на ион, включая внеклеточный Ca2+. Анализ in vitro может быть использован для характеристики селективности, насыщенности и обратимости этих миметиков и литиков по стандартным методикам.
Процедура скрининга
Обычно бычьи паратироидные клетки, нагруженные fura-2, сначала суспендируют в буфере, содержащем 0,5 мМ CaCl2. Испытуемое вещество прибавляют в кювету в малом объеме (5-15 мкл) и отмечают любые изменения сигнала флуоресценции. Проводят кумулятивное увеличение концентрации испытуемого вещества в кювете до тех пор, пока не достигнут какой-либо заранее определенной концентрации или не будут отмечены изменения сигнала флуоресценции. Если не отмечаются изменения сигнала флуоресценции, молекула считается неактивной и дальнейшие испытания не проводят. При начальных исследованиях, например с молекулами типа полиамина, молекулы испытывают при таких высоких концентрациях как 5-10 мМ. Поскольку теперь известны более мощные молекулы (см. ниже), максимальную концентрацию снижают. Например, более новые молекулы испытывали при концентрациях до 500 мМ или менее. Если не отмечается изменений при флуоресценции при этой концентрации, молекула может считаться неактивной.
Молекулы, вызывающие увеличение /Ca2+/в, подвергают дополнительным исследованиям. Двумя основными характеристиками молекулы, существенными для признания ее кальцимиметической молекулой, являются мобилизация внутриклеточного Ca2+ и чувствительность к РКС активаторам. Было найдено, что молекулы, вызывающие мобилизацию внутриклеточного Ca2+ ФМА-чувствительным образом, однозначно являются кальцимиметическими молекулами и ингибируют секрецию ПТГ. При необходимости могут быть проведены дополнительные испытания для подтверждения этого мнения. Далее, если молекула вызывает мобилизацию внутриклеточного Ca2+ ФМА-чувствительным образом, ее направляют на скрининг на человеческих паратироидных клетках. Например, проводят измерения /Ca2+/в для определения ЭК50 и измеряют способность молекулы ингибировать секрецию ПТГ в человеческих паратироидных клетках, которые были получены от пациентов, подвергшихся операции по первичному или вторичному гиперпаратироидизму. Более низкие ЭК50 или ИК50 соответствуют более мощным как кальцимиметики или кальцилитики молекулам.
Измерение /Ca2+/в с fura-2 обеспечивает очень быстрое средство скрининга новых органических молекул по активности. За день может быть исследовано 10-15 молекул и оценена их способность мобилизовать внутриклеточный Ca2+ (или нет). Также может быть оценена чувствительность любого наблюдаемого увеличения /Ca2+/в к понижению ФМА. Кроме того, один клеточный препарат может обеспечить данные по /Ca2+/в, уровню циклического АМФ, ИФ3 и секреции ПТГ. Типичная процедура заключается в нагрузке клеток fura-2 и последующем разделении клеточной суспензии на две, большую часть клеток используют для измерения /Ca2+/в, а оставшиеся инкубируют с молекулами для оценки их действия на циклический АМФ и секрецию ПТГ. Благодаря чувствительности радиоиммуноанализа к циклическому АМФ ПТГ, обе переменные могут быть определены в одной инкубационной пробирке, содержащей 0,3 мл клеточной суспензии (около 500000 клеток). Измерения инозитолфосфатов требуют затрат времени при скрининге. Однако ионообменные колонки, элюируемые хлоридом (а не форматом), обеспечивают быстрое средство для скрининга образования ИФ3, поскольку не требуется применения роторного испарения (на которое затрачивается около 30 часов). Этот способ позволяет обработать около 100 образцов за один день. Те молекулы, которые вызывают интерес при оценке по измерению /Ca2+/в, циклического АМФ, ИФ3 и ПТГ, затем подвергают более строгому анализу путем исследования образования различных инозитолфосфатов и оценки их изомерных форм ВЭЖХ.
Интересные молекулы, определенные в этих протоколах, затем оценивают на специфичность, например, исследуя их влияние на /Ca2+/в в кальцитонинсекретирующих C-клетках, используя, например, клеточную линию МТС 6-23 крыс.
Ниже приводятся иллюстрации методик, полезных для этих скрининговых процедур. Примеры типичных результатов для различных испытаний кальцимиметических или кальцилитических молекул приведены на фиг. 2-34.
Получение паратироидной клетки
Паратироидные железы получают от свежезабитых детенышей (в возрасте 12-15 недель) на местной скотобойне и транспортируют в лабораторию в охлажденном на льду буфере для паратироидных клеток (ПКБ), который содержит (мМ): NaCl 126, KCl 4, MgCl2 1, Na-HEPES 20, pH 7,4, глюкоза 5,6 и различные количества CaCl2, например 1,25 мМ. Человеческие паратиродиные железы, полученные от пациентов, подвергнувшихся хирургическому удалению паратироидной ткани при первичном или уремическом гиперпаратироидизме (ГПТ), обрабатывали так же, как и бычьи ткани. Железы обрезают от избытка жира и соединительной ткани, а затем режут тонкими ножницами на кубики приблизительно 2-3 мм. Готовят диссоциированные клетки при переваривании коллагеназой. Диссоциированные клетки затем очищают центрифугированием в буфере Перколля. Полученный в результате препарат паратироидных клеток по существу не содержит красных кровяных клеток, адипоцитов и капиллярной ткани, как проверено фазовой контрастной микроскопией и окрашиванием Суданом черным B. Диссоциированные и очищенные паратироидные клетки находятся в виде маленьких кластеров, содержащих 5-20 клеток. Клеточная вариабельность, как показано исключением трипаном синим или этидиний бромидом, обычно составляет 95%.
Хотя для экспериментальных целей клетки могут быть использованы в этой точке, физиологические ответы (суперподавляемость секреции ПТГ и остаточные уровни /Ca2+/в) будут лучше после культивирования клеток в течение ночи. Первичная культура также имеет то преимущество, что клетки могут быть помечены изотопами вблизи изотопного равновесия, как необходимо для исследований, включающих измерения метаболизма инозитолфосфата (см. ниже). После очистки на градиентах Перколля клетки несколько раз промывают смесью 1:1 Хэм F12 - Дульбекко модифицированной средой Игла (GIBCO), дополненной 50 г/мл стрептомицина, 100 E/мл пенициллина, 5 г/мл гентамицина и ИТС+. ИТС+ представляет собой предварительно смешанный раствор, содержащий инсулин, трансферрин, селен и бычий сывороточный альбумин/БСА/ - линоленовую кислоту (Collaborative Research, Bedford, MA). Затем клетки переносят в пластиковые колбы (75 или 150 см2, Фалькон) и инкубируют при 37oC во влажной атмосфере 5% CO2. Не добавляют сыворотку к этим ночным культурам, поскольку ее наличие позволяет клеткам присоединяться к пластику, вызывает пролиферацию и дедифференцирование. Клетки, культивированные в указанных выше условиях, легко удаляются из колбы декантацией и показывают такую же вариабельность, как и свежеприготовленные клетки.
Измерение цитозольного Ca2+
Очищенные паратироидные клетки снова суспендируют в 1,25 мМ CaCl2 - 2% БСА - ФСБ, содержащем 1 М fura-2-ацетоксиметилового эфира, и инкубируют при 37oC в течение 20 минут. Затем клетки осаждают центрифугированием, повторно суспендируют в том же буфере, удаляя эфир, и инкубируют еще 15 минут при 37oC. Клетки последовательно промывают дважды ФСБ, содержащим 0,5 мМ CaCl2 и 0,5% БСА, и выдерживают при комнатной температуре (около 20oC). Непосредственно перед использованием клетки разбавляют в пять раз предварительно подогретым 0,5 мМ CaCl2 - ФСБ, чтобы получить конечную концентрацию БСА 0,1%. Концентрация клеток в кювете, использованной для измерения флуоресценции, составляет 1-2106 /мл.
Флуоресценцию нагруженных индикатором клеток измеряют при 37oC на спектрофлуориметре (Biomedical Instrumentation Group, Universtity of Pennsylvania, Phyladelphia, PA), оборудованном держателем термостатированной кюветы и магнитной мешалкой, используя длины волн возбуждения и эмиссии 340 и 510 нм соответственно. Эта флуоресценция показывает уровень цитозольного Ca2+. Сигналы флуоресценции калибруют, используя дигитонин (50 г/мл, конечная), чтобы получить максимум флуоресценции (Fmax), и EGTA (10 мМ, pH 8,3, конечная), чтобы получить минимальную флуоресценцию (Fmin), и константу диссоциации 224 нм. Утечка красителя зависит от температуры и чаще всего происходит в первые 2 минуты после нагревания клеток в кювете, утечка красителя увеличивается только очень медленно после этого. Чтобы точно откалибровать утечку красителя, клетки помещают в кювету и перемешивают при 37oC в течение 2-3 минут. Затем удаляют клеточную суспензию, клетки осаждают центрифугированием и надосадочную жидкость возвращают в чистую кювету. Надосадочную жидкость затем обрабатывают дигитонином и EGTA, как выше, чтобы получить оценку утечки красителя, которая составляет обычно 10-15% от суммарного Ca2+-зависимого флуоресцентного сигнала. Эту оценку вычитают из кажущейся Fmin.
Измерение секреции ПТГ
В большинстве экспериментов используют клетки, нагруженные fura-2, при исследовании секреции ПТГ. Нагруженные fura-2 паратироидные клетки не изменяют своего секреторного ответа на внеклеточный Ca2+. Клетки суспендируют в ПСБ, содержащем 0,5 мМ CaCl2 и 0,1% БСА. Инкубацию проводят в пластиковых пробирках (Фалькон 2058), содержащих 0,3 мл клеточной суспензии с или без малых объемов CaCl2 и/или органических поликатионов. После инкубации при 37oC в течение различного времени (обычно 30 мин) пробирки помещают на лед и клетки осаждают центрифугированием при 2oC. Образцы надосадочной жидкости доводят до pH 4,5 уксусной кислотой и хранят при -70oC. Этот протокол используют как для бычьих, так и человеческих паратироидных клеток.
Для бычьих клеток количество ПТГ в образцах надосадочной жидкости определяют путем гомологического радиоиммуноанализа с использованием GW-1 антитела или его эквивалента при конечном разбавлении 1/45000. 125I-ПТГ (65-84, ИНКСТАР, Стиллвотер, МН) используют в качестве метки и разделяют фракции с помощью активированного декстраном угля. Счет образцов и данные восстановления осуществлены на гамма-счетчике Паккард Кобра 5005.
Для человеческих клеток используют коммерчески доступный радиоиммунологический аналитический набор (INS-PTH; Nichols Institute, Los Angeles, CA - Николс Инститьют, Лос Анжелес, КА), который распознает интактный и N-концевой человеческий ПТГ, потому что GW-1 антитело плохо распознает человеческий ПТГ.
Измерение циклического АМФ
Клетки инкубировали, как описано выше, для изучения секреции ПТГ и в конце инкубации отбирают образец 0,15 мл и переносят в 0,85 мл горячей (70oC) воды и нагревают при этой температуре в течение 5-10 минут. Пробирки затем несколько раз замораживают и оттаивают и клеточный дебрис осаждают центрифугированием. Порции надосадочной жидкости ацетилируют и определяют концентрации циклического АМФ радиоиммуноанализом.
Измерение образования инозитолфосфата
Метят фосфолипидные мембраны путем инкубирования паратироидных клеток с 4 мКю/мл 3H-инозитола в течение 20-24 часов. Затем клетки промывают и снова суспендируют в ФСБ, содержащем 0,5 мМ CaCl2 и 0,1% БСА. Инкубации проводят в микроцентрифужных пробирках в отсутствие и в присутствии различных концентраций органического поликатиона в течение различного времени. Реакции заканчивали добавлением 1 мл хлороформа/метанола/ 12 N HCl (200:100:1, объем/объем/объем). Затем прибавляют водный гидролизат фитиновой кислоты (200 мкл), 25 мг фосфата /пробирку/. Пробирки центрифугируют и 600 мкл водной фазы разбавляют в 10 мл воды.
Инозитолфосфаты разделяют ионообменной хроматографией, используя AGI-X8 в хлорид- или форматной форме. Когда должны быть определены только уровни ИФ3, используют хлоридную форму, тогда как используют форматную форму для разрешения основных инозитолфосфатов /ИФ3, ИФ2 и ИФ1/. Для определения только ИФ3 разбавленный образец наносят на колонку в хлоридной форме и промывают колонку 10 мл 30 мМ HCl, затем 6 мл 90 мМ HCl и элюируют ИФ3 3 мл 500 мМ HCl. Последний элюат разбавляют и подсчитывают. Для определения всех основных инозитолфосфатов разбавленный образец наносят на колонку в форматной форме и элюируют последовательно ИФ1, ИФ2 и ИФ3 путем увеличения концентраций форматного буфера. Образцы, элюированные из форматных колонок, подвергают роторному испарению, остатки переводят в коктейль и подсчитывают.
Изомерные формы ИФ3 оценивают ВЭЖХ. Реакции прекращают добавлением 1 мл 0,45 М перхлорной кислоты и хранят на льду в течение 10 мин. После центрифугирования устанавливают pH надосадочной жидкости равным 7-8 с помощью NaHCO3. Экстракт затем наносят на Партисил SAX анионообменную колонку и элюируют при линейном градиенте формата аммония. Различные фракции затем обессоливают Дауэксом с последующим роторным испарением перед жидкостным сцинцилляционным счетом на Паккард Трикарб 1500 LSC.
Для всех методов разделения инозитолфоcфатов были использованы соответствующие контроли с применением аутеничных стандартов для определения, не препятствуют ли органические поликатионы разделению. Если это так, образцы обрабатывают катионообменной смолой для удаления мешающей молекулы перед разделением инозитолфосфатов.
Измерение цитозольного Ca2+ в C-клетках
Неопластичные С-клетки, происходящие из мозговой тироидной карциномы крысы (r MTC 6-23), полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС N 1607), культивировали в виде монослоев на Дальбеко модифицированной среде игла (ДМЕМ) плюс 15% лошадиной сыворотки в отсутствие антибиотиков. Для измерений /Ca2+/в клетки с 0,02% ЕДТА /0,05% трипсина промывают дважды ФСБ, содержащим 1,25 мМ CaCl2 и 0,5% ВСА, и нагружают fura-2, как описано выше для паратироидных клеток. Измерения /Ca2+/в проводят, как описано выше, с соответствующими коррективами для утечки красителя.
Измерение /Ca2+/в в остеокластах крысы
Остеокласты были получены из 1-2-дневных крыс Спраг-Дейли с использованием асептических условий. Крысят умерщвляли обезглавливанием, удаляли задние лапы, быстро освобождали бедра от мягкой ткани и помещали в предварительно подогретую F-12/ДМЕМ среду, ДМЕМ содержит 10% фетальной телячьей сыворотки и антибиотики (пенциллин - стрептомицин - гентамицин, 100 E/мл - 100 нг/м - 100 г/мл). Кости двух крысят разрезали вдоль длины и помещали в 1 мл культуральной среды. Костные клетки получают при осторожном растирании в порошок костных фрагментов пластиковой пипеткой и разбавлении культуральной средой. Костным фрагментом дают отстояться и равные порции (около 1 мл) среды переносят на культуральный планшет с 6-ю ячейками, имеющими 25-миллиметровые стеклянные покровные стекла. Клеткам дают осесть в течение 1 часа при 37oC во влажной атмосфере 5% CO2 - воздух. Покровные стекла затем промывают 3 раза свежей средой для удаления неприкрепившихся клеток. Измерения /Ca2+/в в остеокластах осуществляют в течение 6-8 часов после удаления неприкрепившихся клеток.
Клетки, прикрепившиеся к покровным стеклам, нагружают indo-1 путем инкубации с 5 М indo-1 ацетоксиметиловым эфиром /0,01% Плюроник F28 в течение 30 минут при 37oC в F-12/ДМЕМ без сыворотки, содержащей вместо этого 0,5% БСА. Покровные стекла затем промывают и инкубируют дополнительно 15 минут при 37oC в F-12/ДМЕМ без эфира перед переносом в камеру суперслияния, смонтированную на предметном столике Никон Диафот инвертного микроскопа, оборудованного для микрофлуориметрии. Остеокласты легко идентифицируются по их большому размеру и наличию множества ядер. Клетки подвергают суперслиянию с буфером (обычно ФСБ, содержащий 0,1% БСА и 1 мМ Ca2+) со скоростью 1 мл/мин с или без испытуемого вещества. Флуоресценция, испускаемая при возбуждении 340 нм, была направлена через световой путь микроскопа на дихроичное зеркало 440 нм, и собирают с помощью фотоумножительных трубок интенсивность флуоресценции при 495 и 405 нм. Пропускные способности фотоумножительных трубок амплифицировали, digitised и хранили в 80386 PC. Соотношения интенсивности флуоресценции использовали для оценки /Ca2+/в.
Экспрессия ооцита
В дополнительных исследованиях в скрининговых протоколах использовали Xenopus ооциты, инъецированные мРНК из бычьих или человеческих паратироидных клеток, и измеряли поток Cl- как косвенный метод контроля повышения /Ca2+/в. Ниже приводится пример испытания влияния неомицина.
Ооциты инъецировали обогащенной поли/A/+-мРНК из человеческой паратироидной ткани (гиперпластичные железы из случая вторичного ГПТ). Через 3 дня ооциты испытывали на их ответ на неомицин. Неомицин B вызывает колеблющееся повышение потока Cl-, которое прекращается при суперслиянии с несодержащим лекарства солевым раствором (см. фиг. 20). Ответы на неомицин B наблюдали при концентрациях между 100 М и 10 мМ. Для обеспечения того, чтобы ответ, вызываемый неомицином B, был зависящим от инъекции паратироидной мРНК, определили влияние неомицина B на потоки в инъецированных водой ооцитах.
В каждом из пяти исследованных ооцитов неомицин B (10 мМ) не вызывал какого-либо изменения в потоке. Известно, что около 40% ооцитов отвечает на карбахол, эффект, медиированный эндогенным мускариновым рецептором. В пяти исследованных ооцитах один показал направленные внутрь потоки в ответ на карбахол, и это показано на фиг. 20б. Следовательно, в клетках, экспрессирующих мускариновый рецептор в сочетании с повышением /Ca2+/в и потоком Cl-, неомицин B не вызывает ответа. Это указывает, что ответ на неомицин B зависит от экспрессии специфического белка, кодируемого мРНК паратироидной клетки. Совершенно серьезно предполагается, что в интактных клетках неомицин B действует непосредственно на Ca2+-рецептор, изменяя функцию паратироидной клетки.
Конструирование лекарства из ведущих молекул
Некоторые органические молекулы имитируют или антагонизируют действие внеклеточного Ca2+ при воздействии на Ca2+-рецептор, как показано здесь. Однако испытанные молекулы необязательно пригодны в качестве кандидатов в лекарства, но они служат для демонстрации того, что гипотеза о терапии, основанной на Ca2+-рецепторе, является правильной. Эти молекулы могут быть использованы для определения структурных признаков, которые могут вызвать их воздействие на Ca2+-рецептор и, следовательно, выбрать молекулы, полезные в настоящем изобретении.
Пример такой аналитической процедуры приводится ниже. Этот пример детализирован в приводимых ниже примерах, но является полезным здесь, чтобы показать основную причину, которая может быть использована для конструирования полезных молекул настоящего изобретения из ведущих молекул, обсуждаемых здесь. Специалистам в данной области известны аналитические стадии, определенные в примере, и что аналогичный анализ может быть проведен на других ведущих молекулах до тех пор, пока не будет определено наиболее желаемое кальцимиметическое или кальцилитическое соединение.
Другие примеры также приведены ниже. Вместе представленные данные показывают, что полезные ведущие молекулы будут иметь ароматические группы, которые предпочтительно замещены в одном или более положениях, и могут иметь разветвленные или линейные, замещенные или незамещенные алкильные группы, как желательно. В дополнение к этому, важно, чтобы выбирались молекулы правильной стереоспецифичности, чтобы обеспечить более высокое сродство к желаемому Ca2+-рецептору. Следовательно, эти данные отмечают в известном уровне техники то, что соответствует ведущим молекулам, которые могут быть дериватизированы для нахождения оптимальных желаемых молекул настоящего изобретения, почти как описано ниже.
Хотя они и различаются по структуре, испытанные молекулы могут иметь общие признаки, которые могут быть исследованы. В этом примере была исследована корреляция между чистым положительным зарядом и мощностью при мобилизации внутриклеточного Ca2+. Протамин /+21; ЭК50 = 40 нМ/ является более эффективным, чем неомицин B (+6; ЭК50 = 20 М в человеческих паратироидных клетках и 40 М в бычьих паратироидных клетках), который является более эффективным, чем спермин (+4; ЭК50 = 150 М) для вызова мобилизации /Ca2+/в в паратироидных клетках. Эти результаты вызывают вопрос, только ли один положительный заряд определяет мощность, или же имеются другие структурные признаки, которые вносят свой вклад в активность на Ca2+-рецепторе. Это важно определить вначале, потому что это в значительной мере согласуется с мнением, что Ca2+-рецептор может быть мишенью для эффективных и специфических терапевтических молекул. Итак, могут быть изучены различные другие органические поликатионы, родственные неомицину B и спермину, для определения соотношения между чистым положительным зарядом молекулы и ее мощностью для мобилизации внутриклеточного Ca2+.
Первую серию исследованных молекул составляют аминогликозиды. Молекулы исследовали на бычьих паратироидных клетках и определяли их ЭК50 для мобилизации внутриклеточного Ca2+. Для аминогликозидов порядок мощности вызывания кратковременного цитозольного Ca2+ располагается следующим образом: неомицин B (ЭК50 = 20 или 40 М), гентамицин (150 М), беканамицин (200 М), стрептомицин (600 М). Канамицин и линкомицин не оказывали воздействия при испытаниях при концентрациях 500 М. Чистый положительный заряд у этих аминогликозидов при pH 7,3 составляет неомицин B /+6/ > гентамицин /+5/ = беканамицин /+5/ > канамицин /средний +4,5/ > стрептомицин /+3/ > линкомицин /+1/. Затем внутри аминогликозидной серии имеется некоторая корреляция между чистым положительным зарядом, но она не является абсолютной и канамицин, про который можно предположить, что он будет более мощным, чем стрептомицин, не проявляет активности.
Испытания различных полиаминов выявили дополнительные и более заметные несоответствия между чистым положительным зарядом и мощностью. Исследовали три структурных класса полиаминов: /1/ с прямой цепью, /2/ с разветвленной цепью и /3/ циклические. Структуры исследованных полиаминов приведены на фиг. 1. Среди полиаминов с прямой цепью спермин /+4; ЭК50 = 150 М/ является более мощным, чем пентаэтиленгексамин /+6; ЭК50 = 500 М/ и тетраэтиленпентамин /+5; ЭК50 = 2,5 М/, хотя последние молекулы имеют больший чистый положительный заряд.
Мы синтезировали некоторые полиамины с разветвленной цепью, которые имели различное количество вторичных и первичных аминогрупп и, следовательно, различались по чистому положительному заряду. Две таких молекулы, NPS 381 и NPS 382, были исследованы на воздействие на /Ca2+/в в бычьих паратироидных клетках. NPS 382 /+8; ЭК50 = 50 М/ является примерно вдвое более мощным, чем NPS 381 /+10; ЭК50 = 100 М/, хотя он имеет вдвое меньший положительный заряд.
Подобное несоответствие между положительным зарядом и мощностью было отмечено в экспериментах с циклическими полиаминами. Например, гексациклен /+6; ЭК50 = 20 М/ является более мощным, чем NPS 383 /+8; ЭК50 = 150 М/. Результаты, полученные с этими полиаминами, показывают, что положительный заряд не является единственным фактором, вносящим свой вклад в мощность.
Дополнительные исследования обеспечили понимание структурных признаков молекул, которые придают активность по отношению к Ca2+-рецептору паратироидной клетки. Одним из структурно важных признаков является внутримолекулярное расстояние между азотами (которые несут положительный заряд). Так, спермин является в 50 раз более мощным, чем триэтилентатрамин (ЭК50 = 8 мМ) при вызывании увеличения /Ca2+/в в бычьих паратироидных клетках, ходя обе молекулы несут чистый положительный заряд +4. Единственным различием в структуре между этими двумя полиаминами является количество метиленовых групп, разделяющих азоты: у спермина оно равно 3-4-3, тогда как у триэтилентатрамина оно равно 2-2-2. Это кажущееся незначительным изменение в расстояниях между азотами обеспечивает существенные различия мощности, и полагают, что конформационные соотношения между азотами внутри молекулы являются критическими. Это поддерживается результатами, полученными с гексацикленом и пентаэтиленгексамином. Первая молекула является просто циклическим аналогом последней и содержит такое же количество метиленовых групп между всеми азотами, хотя наличие циклической структуры увеличивает мощность в 25 раз. Эти результаты указывают, что сам по себе положительный заряд не является критическим фактором, определяющим активность органической молекулы по отношению к Ca2+-рецептору.
Другие серии экспериментов выявили важность ароматических групп при определении активности по отношению к Ca2+-рецептору. Результаты были получены с двумя арилалкиламинами, выделенными из яда паука Argiope lobata. Эти молекулы, аргиотоксин 636 и аргиотоксин 659, имеют идентичные поликатионные участки, соединенные с различными ароматическими группами (фиг. 24). Аргиотоксин 659 вызывает колеблющееся увеличение /Ca2+/в в бычьих паратироидных клетках при испытаниях при концентрации от 100 до 300 М. Напротив, аргиотоксин 636 не оказывает такого действия при испытаниях при подобных концентрациях (фиг. 24). Единственное различие в структуре между этими двумя арилалкиламинами находится в ароматической части молекулы: аргиотоксин 659 содержит 4-оксииндольный фрагмент, тогда как аргиотоксин 636 содержит 2,4-диоксифенильную группу. Чистый положительный заряд на этих двух арилалкиламинах является одинаковым /+4/, так что их различные мощности должны быть результатом различия в ароматических группах. Это показывает, что чистый положительный заряд один не определяет мощность. Однако реальной значимостью этих данных является открытие того, что ароматические группы вносят значительный вклад в способность молекул активировать Ca2+-рецептор.
Агатоксин 489 /NPS 017/ и Агатоксин 505 /NPS 015/ оба вызывают мобилизацию внутриклеточного Ca2+ в паратироидных клетках с ЭК50 6 и 22 М соответственно. Единственным различием в структуре этих молекул является гидроксильная группа в индольном фрагменте (фиг. 1). Это показывает, что замещения в ароматической части молекулы могут оказывать влияние на мощность. Это указывает, что должны быть изучены другие ведущие молекулы, включая молекулы, имеющие замещенные ароматические фрагменты.
Структурные признаки, систематически варьируемые в ведущих молекулах, описанных здесь, включают (1) чистый положительный заряд, (2) количество метиленовых групп, разделяющих азоты, и (3) циклические варианты, например, полиаминов с и без изменений расстояний за счет метиленовых групп и чистого положительного заряда. В дополнение к систематическим вариациям структуры может быть исследовано место расположения ароматических групп, например, в различных арилалкиламинах, выделенных из ядов ос и пауков, и могут быть получены синтетические молекулы путем сочетания коммерчески доступных ароматических фрагментов с аргиотоксинным полиаминым фрагментом. Аргиотоксинный полиаминный фрагмент можно легко просочетать с любым ароматическим фрагментом, содержащим карбоновую кислоту. Следовательно, просто подвергнуть скринингу гидроксильные и метоксипроизводные фенилуксусной кислоты и бензойной кислоты, а также серий оксииндолуксусной кислоты. Также могут быть получены аналоги, содержащие гетероароматические функциональности и оценена их активность.
Сравнение мощности и эффективности среди таких молекул выявит оптимальную структуру и место расположения ароматической группы при постоянном положительном заряде.
Одна из структурных вариаций полиаминового фрагмента, который возможно повышает мощность, представляет собой циклическую версию родственной молекулы с прямой цепью. Будмунхиамин A, выделенный из растения Albizia amara, представляет собой циклическое производное спермина (фиг. 1). Добавление будмунхиамина A к бычьим паратироидным клеткам вызывает быстрое и кратковременное увеличение /Ca2+/в, которое существует в отсутствие внеклеточного Ca2+ и притупляется предварительной обработкой ФМА. Следовательно, он вызывает мобилизацию внутриклеточного Ca2+ в паратироидных клетках, возможно воздействуя на Ca2+-рецептор. Он является равномощным со спермином /ЭК50 около 200 М/, хотя несет на один положительный заряд меньше /+3/, чем спермин.
Результаты, полученные с будмунхиамином A, показывают предсказуемую важность исследований структура - активность, и нужно получить новую структурную информацию при испытаниях природных продуктов. Так, легко осуществляется скрининг природных продуктов, рационально отобранных на основании структурной информации, например молекулы могут быть отобраны на основании хорошо установленных хемотаксономических принципов с использованием оснований с соответствующими данными, таких как Напралерт (Napralert). Например, макроциклические полиаминные алкалоиды, происходящие из мотыльковых бобовых культур, относящихся к Albizia, таких как Pithocolobium, и другие происходящие из растений молекулы могут быть подвергнуты скринингу.
На фиг. 36 представлен второй пример из серии молекул, которые были подвергнуты скринингу для определения полезных молекул настоящего изобретения. Эти молекулы обычно происходят из фендилина и испытаны для определения их соответствующих ЭК50. Кроме того, испытания родственных молекул, таких как NPS 447 и NPS 448, показали стереоспецифические эффекты молекулярной структуры. Наиболее активные соединения, испытанные до настоящего времени, являются новыми соединениями, обозначенными NPS 467 и NPS 568, которые имеют величины ЭК50 менее 5 М. На данном уровне техники при рассмотрении этих серий молекул могут быть определены другие подходящие производные, которые могут быть испытаны в изобретении.
Эти примеры показывают общую схему и процесс скрининга, полезные в настоящем изобретении, и указывают, что банки дополнительных соединений и природных продуктов могут быть скринированы, как желательно для специалистов в данной области, чтобы определить другие полезные ведущие молекулы или новые молекулы настоящего изобретения.
Как обсуждалось выше, примеры молекул, полезных в качестве кальцимиметиков, включают разветвленные или циклические полиамины, положительно заряженные полиаминокислоты и арилалкиламины. Кроме того, другие положительно заряженные органические молекулы, включая молекулы природного происхождения и их аналоги, являются полезными кальциметиками. Эти молекулы природного происхождения и их аналоги предпочтительно имеют такое соотношение заряда к массе, которое коррелирует с этими соотношениями для приведенных здесь в качестве примеров молекул. (Примеры включают материалы, выделенные из морских видов, ядов членистоногих, наземных растений и ферментационных бульонов, происходящих из бактерий и грибов). Предполагается, что одна группа предпочтительных молекул природного происхождения и полезных аналогов в качестве кальцимиметиков будет иметь отношение положительный заряд : молекулярная масса (в дальтонах) от примерно 1:40 до 1:200, предпочтительно от примерно 1: 40 до 1:100. Более определенные примеры таких молекул приведены ниже.
Полиамины
Полиамины, полезные как кальцимиметики в настоящем изобретении, могут быть разветвленными или циклическими. Разветвленные или циклические полиамины потенциально обладают более высокой кальцимиметической активностью, чем их аналоги с прямой цепью. То есть разветвленные или циклические полиамины обычно обладают более низкой ЭК50, чем соответствующие линейные полиамины с таким же эффективным зарядом при физиологическом pH (см. табл. 1).
"Разветвленные полиамины", как использовано здесь, означают цепную молекулу, состоящую из коротких алкильных мостиков или алкильных групп, соединенных вместе аминными связями, и также содержащую точки, в которых цепь разветвляется. Эти "точки разветвления" могут быть локализованы или у атома углерода, или у атома азота. Точка разветвления у атома азота представляет собой обычно третичный амин, но он также может быть четвертичным. Разветвленный полиамин может иметь 1-20 точек разветвления, предпочтительно 1-10 точек разветвления.
Обычно алкильные мостики и алкильные разветвления в разветвленных полиаминах содержат 1-50 атомов углерода в длину, предпочтительно 2-6 атомов углерода. Алкильные разветвления также могут быть прерваны одним или более гетероатомами (азотом, кислородом или серой) или замещены функциональными группами, такими как галоид, включая фтор, хлор, бром или йод, гидроксилонитро, ацилокси (R'COO-), ациламидо (R'CONH-), или алкокси (-OR'), где R' может содержать 1-4 атома углерода. Алкильные разветвления также могут быть замещены группами, которые положительно заряжены при физиологическом pH, такими как амино или гуанидо. Эти функциональные заместители могут добавлять или изменять физические свойства, такие как растворимость для повышения активности, выделение или биодоступность молекулы.
Разветвленные полиамины могут иметь три или более цепей и точек концевых разветвлений. Эти концевые точки могут быть метильными группами или аминогруппами, предпочтительно аминогруппами.
Одна предпочтительная группа молекул представляет собой группу разветвленных полиаминов, имеющих формулу
H2N -/CH2/j -/NRi -/CH2/j /k - NH2
где k является целым числом от 1 до 10, каждый j является одинаковым или различным и является целым числом от 2 до 20, и каждый Ri является одинаковым или различным и выбран в группе, состоящей из водорода и /CH2/j - NH2, где j имеет указанные ранее значения, и по крайней мере один Ri не является водородом.
Особенно предпочтительными разветвленными полиаминами настоящего изобретения являются молекулы N1, N1, N5, N10, N14, N14-гексакис-/3-аминопропил/спермина и N1, N1, N5, N14, N14-тетракис-/3-аминопропил/спермина, упоминаемые как NPS 381 и NPS 382 соответственно на фиг. 1.
"Циклические полиамины", как использовано здесь, относятся к гетероциклам, содержащим два или более гетероатома (азота, кислорода или серы), по крайней мере два из которых являются атомами азота. Гетероциклы обычно имеют от примерно 6 до примерно 20 атомов в цикле, предпочтительно от примерно 10 до примерно 18 атомов в цикле. Гетероатомы азота разделены 2-10 атомами углерода. Гетероциклы также могут быть замещены у азотных центров аминоалкильными или аминоарильными группами /NH2-R-/, где R является аминоарилом или низшим алкилом с 2-6 атомами углерода.
Особенно предпочтительные циклические полиамины настоящего изобретения показаны на фиг. 1 в виде гексациклена /1,4,7,10,13,16-гексаазациклооктадекана/ и NPS 383.
Полиаминокислоты
Полиаминокислоты, полезные в настоящем изобретении, могут содержать два или более положительно заряженных аминокислотных остатка при физиологическом pH. Эти положительно заряженные аминокислоты включают гистидин, лизин и аргинин. Эти полипептиды будут варьировать по длине от 2 до 800 аминокислот в длину, предпочтительно от 20 до 300 аминокислот в длину. Эти полипептиды могут состоять из единственного повторяющегося аминокислотного остатка или могут иметь различные белки природного происхождения или ферменты.
Аминокислотные остатки, составляющие полиаминокислоты, могут быть любыми из двадцати встречающихся в природе аминокислот, или другими альтернативными остатками. Альтернативные остатки включают, например, позиции настоящего изобретения и также могут содержать компоненты, происходящие из молекулы или иона, которые действуют как метка. Может быть использовано большое разнообразие метящих фрагментов, включая радиоизотопы, хромофоры и флуоресцентные метки. Радиоизотопная метка особенно легко детектируется in vivo. Радиоизотопы могут быть введены координацией в виде катионов в порфириновую систему. Полезные катионы включают технеций и индий. В композициях положительно заряженная молекула может быть связана или ассоциирована с меткой.
Способы синтеза
Стратегии синтеза и модификация полиаминов включают использование различных групп, защищающих аминогруппу (фталимидо, BOC, CBZ, бензил и нитрил), которые могут быть селективно удалены для конструирования функционализированной молекулы. Включенные способы синтеза являются модельными, после того как их использовали для конструирования аргиопинов 636 и 659 и других арилалкиламино, происходящих из ядов пауков.
Протяженность цепи из 2-4 метиленовых групп обычно создается путем алкилирования соответствующим N-/бромалкил/фталимидом. Смесь 1:1,2 амина и бромалкилфталимида кипятят с обратным холодильником в ацетонитриле в присутствии 50% KF на Целите. Удлинение цепи также осуществляют путем алкилирования заданного амина акрилонитрилом или этилакрилатом. За ходом реакции следят с помощью ТСХ и очищают промежуточные продукты на силикагеле, используя сочетания дихлорметана, метанола и изопропиламина. Конечные продукты очищают катионным обменом /HEMA-SB// и ВЭЖХ-ОФ /Видак C-18/. Чистоту и структуру подтверждают с помощью 1H- и 13C-ЯМР и масс-спектрометрией высокого разрешения /EI, CI и/или FAB/.
BOC-защищающие группы вводят при обработке амина /1oC или 2o/ дитрет-бутилдикарбонатом в дихлорметане в присутствии каталитического количества диметиламинопиридина. Бензильные защищающие группы вводят одним из двух путей: /1/ конденсацией 1o амина с бензальдегидом с последующим восстановлением боргидридом натрия или /2/ алкилированием 2o амина бензилбромидом в присутствии KF. Амидные связки и циклизации обычно осуществляют при реакции амина (1o или 2o) со сложным эфиром N-оксисукцинимида данной кислоты. Это осуществляется непосредственно (в случае циклизаций) при обработке "аминокислоты" дициклогексилкарбодиимидом в разбавленных условиях.
Снятие защиты фталимидной функциональностью осуществляют восстановлением гидразином при кипячении с обратным холодильником в метаноле. Снятие защиты BOC-функциональностью осуществляют в безводной ТФУК. Снятие защиты бензильной, нитрильной и CBZ-функциональностями осуществляют путем восстановления в ледяной уксусной кислоте под давлением водорода 55 фунт/дюйм2 (= 3,867 кг/см2) в присутствии каталитического количества гидроксида палладия на угле. Нитрильные функциональности (в присутствии бензильных и CBZ групп) селективно восстанавливаются водородом в присутствии губчатого никеля Ренея.
Специально разветвленные полиамины обычно получают из простых диаминоалканов формулы NH2-/CH2/n - NH2, или простых полиаминов, таких как спермидин или спермин. Один из двух первичных (концевых) аминов защищают или "маскируют" защищающей группой, такой как BOC /трет-бутилоксикарбонил/, фталимидо, бензил, 2-этилнитрил /продукт реакции конденсации Михаэля амина и акрилонитрила/, или амид. Типичная реакция заключается в присоединении BOC-защищающей группы при обработке ди-трет-бутилдикарбонатом (BOC-ангидридом)
Монозащищенный продукт отделяют от незащищенного и дизащищенного продуктов с помощью простой хроматографической методики или дистилляцией.
Оставшийся свободный амин в монозащищенном продукте затем селективно алкилируют (или ацилируют) алкилирующим (или ацилирующим) агентом. Для обеспечения моноалкилирования свободный амин частично защищают конденсацией с бензальдегидом с последующим восстановлением боргидридом натрия с образованием N-бензильного производного
N-Бензильное производное затем вводят в реакцию с алкилирующим агентом. Типичным алкилирующим агентом является N-/бромалкил/фталимид, который реагирует следующим образом:
Например, используют N-/бромбутил/фталимид для удлинения или разветвления цепи на четыре метиленовые группы. Альтернативно, реакция с акрилонитрилом с последующим восстановлением цианогруппы будет удлинять цепь на три метиленовые группы и аминогруппу.
Защищающие группы на полученной в результате молекуле с удлиненной цепью затем могут быть селективно отщеплены с получением нового свободного амина. Например, используют трифторуксусную кислоту для удаления BOC-группы, каталитическое гидрирование используют для восстановления нитрильной функциональности и удаления бензильной группы, а гидразин используют для удаления фталимидных групп следующим образом:
Новый свободный амин может быть алкилирован (или ацилирован) затем, как указано выше, для увеличения длины полиамина. Этот процесс повторяют до тех пор, пока не получат желаемую длину цепи и количество разветвлений. На конечной стадии снятие защиты с продукта приводит в результате к желаемому полиамину. Однако могут быть проведены дополнительные модификации на защищенном конце перед снятием защиты следующим образом.
Например, перед BOC-защиты полиамин ацилируют сложным эфиром П-оксисукцинимида и 3,4-диметоксифенилуксусной кислоты с получением дизащищенного полиамина
Это приводит в результате к получению арилалкилполиамина. Затем селективно удаляют BOC-группы с помощью трифторуксусной кислоты, чтобы открыть другой аминоконец, который может быть удлинен, как описано выше.
Некоторые разветвленные полиамины могут быть получены путем одновременного алкилирования или ацилирования свободных первичных и вторичных аминов в полиамине, полученном, как выше. Например, обработка спермина избытком акрилонитрила с последующим каталитическим восстановлением приводит к следующему:
Циклические амины могут быть получены, как выше, начиная с таких исходных материалов, как гексацилен (Aldrich Chem.).
Полиаминокислоты, входящие в область настоящего изобретения, могут быть получены рекомбинантными методиками, известными на данном уровне техники, или могут быть синтезированы с использованием стандартных твердофазных методик, известных на данном уровне техники. Твердофазный синтез начинают с карбоксильного конца пептида, используя -аминозащищенную аминокислоту. Могут быть использованы BOC-защищающие группы для всех аминогрупп, даже если пригодны другие защищающие группы. Например, BOC-lys-OH может быть этерифицирован на подложке из хлорметилированной полистирольной смолы. Подложка из полистирольной смолы предпочтительно представляет собой сополимер стирола с примерно 0,5-2% дивинилбензола в качестве сшивающего агента, который делает полистирольный полимер полностью нерастворимым в некоторых органических растворителях. Смотри Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis /1969/, W. H. Freeman Co., San Francisco; и Merrifield J. Am. Chem. Soc. /1963/ 85: 2419-2154. Эти и другие методы пептидного синтеза также подтверждаются примерами в патентах США NN 3862925, 3842067, 3972859 и 4105602.
Пептидный синтез может использовать ручные методики или быть осуществлен автоматически с использованием, например, Applied Biosystems 403A Peptide Synthesizer /Foster City, California/ или Biosearch SAM II автоматический пептидный синтезатор /Biosearch, Inc., San Rafael, California/, следуя инструкциям, приведенным в инструктивном руководстве, прилагаемом производителем.
Арилалкиламины являются природными продуктами, выделенными по известным методикам, или синтезированы, как описано Jasys et al., Tetrahedrom Lett. /1988/, 29: 6223-6226, и Nason et al., Tetrahedron Lett. /1989/ 30: 2337-2340.
Один общий протокол получения фендилина /или аналогов фендилина, показанных на фиг. 36/ является следующим. В круглодонной колбе емкостью 10 мл, снабженной стержневой магнитной мешалкой и каучуковой перегородкой, обрабатывают 1,0 ммоль 3,3'-бисфенилпропиламина (или первичного алкиламина) в 2 мл этанола 1,1 ммоль фенола и 1,0 ммоль ацетофенола /или замещенного ацетофенона/. Туда прибавляют 2,0 ммоль MgSO4 и 1,0 ммоль NaCHBH3. Смесь перемешивают в атмосфере азота при комнатной температуре /около 20oC/ в течение 24 часов. Реакционную смесь выливают в 50 мл эфира и 3 раза промывают 1 N NaOH и один раз рассолом. Эфирный слой сушат над безводным K2CO3 и разгоняют в вакууме. Затем продукт очищают хроматографией на колонке или ВЭЖХ, содержащей стационарную фазу из оксида кремния с сочетаниями CH2Cl2-метанол-изопропиламин /обычно 3% метанола и 0,1% изопропиламина в метиленхлориде/.
В предпочтительной процедуре получения фендилина или аналогов фендилина (таких как представлены на фиг. 36) используют изопропоксид титана /IV/ и она была модифицирована исходя из методов, описанных в J. Org. Chem. 55: 2552 /1990/. Для синтеза NPS 544 был использован тетрахлорид титана /способ описан в Tetrahedron Letters 31: 5547 /1990// вместе изопропоксида титана /IV/. Реакционная схема представлена на фиг. 43а. На фиг. 43а R, R' и R'' означают углеводородные группы. В соответствии с одним вариантом в колбе емкостью 4 мл смешивают 1 ммоль амина /1// обычно первичного амина/ и 1 ммоль кетона или альдегида /2/ /обычно ацетофенона/, затем обрабатывают 1,25 ммоль изопропоксида титана /IV/ /3/ и оставляют при перемешивании при комнатной температуре на 30 минут. Альтернативно может быть использован вторичный амин вместо /1/. Некоторые реакции будут давать тяжелые осадки или твердые продукты, которые подогревают/нагревают (до их точки плавления), чтобы обеспечить перемешивание/смешивание в течение некоторого времени во время реакции. Реакционную смесь обрабатывают 1 мл этанола, содержащего 1 ммоль цианборгидрида натрия /4/ и полученную смесь затем оставляют при комнатной температуре при перемешивании время от времени на 16 часов. После этого времени реакцию закаливают, добавляя примерно 500 мкл воды. Потом реакционную смесь разбавляют примерно 4 мл в сумме этилового эфира и затем центрифугируют. Удаляют верхнюю органическую фазу и выпаривают на роторном испарителе. Полученный продукт /6/ частично очищают хроматографией на короткой колонке с силикагелем /или альтернативно, используя препаративную ТСХ на оксиде кремния/, используя сочетание дихлорметан:метанол:изопропиламин /обычно 95: 5: 0,1/, перед очисткой с помощью ВЭЖХ /нормальная фаза с использованием оксида кремния с дихлорметаном:метанолом:изопропиламином или обращенная фаза, C-18 с 0,1% ТФУК с ацетонитрилом или метанолом/.
Если подходит или желательно, может быть проведено хиральное разделение с использованием таких методов, как описано в примере 21.
Рецептура и введение
Как показано здесь, молекулы изобретения могут быть использованы для:
а) имитации или антагонизма одного или более эффектов внеклеточного иона, включая внеклеточный Ca2+;
б) влияния на уровень свободного внеклеточного Ca2+ у индивидуума; и
в) лечения таких заболеваний, как гиперпаратироидизм, остеопороз и гипертония.
Обычно заболевания или состояния, включающие рецептор неорганического иона, теперь могут быть изучены, диагностированы и/или благоприятно пролечены. Хотя в общем было показано, что молекулы оказывают действие на паратироидные клетки, они также могут модулировать Ca2+-рецепторы на других клетках, включая костные остеокласты, окологломерулярные почечные клетки, проксимальные почечные канальцевые клетки, периферические канальцевые почечные клетки, клетки толстой восходящей ветви петли Хенля и/или собирающей протоки, кератиноцит в эпидермисе, парафолликулярные клетки в тироиде /C-клетки/, интестинальные клетки, трофобласт в плаценте, тромбоцит, васкулярную клетку гладкой мышцы, клетки сердечного предсердия, клетки, секретирующие гастрин и глюкагон, почечную мезангиальную клетку и клетку грудной железы.
Хотя эти молекулы обычно используют при лечении людей, они могут быть использованы для лечения подобных и идентичных заболеваний у других теплокровных животных, таких как другие приматы, сельскохозяйственные животные, такие как свиньи, коровы и птица; и спортивных животных и домашних животных, таких как лошади, собаки и кошки.
При терапевтических и/или диагностических применениях молекулы изобретения могут быть сформулированы для различных способов введения, включая системное и местное или локализованное введение. Методики и рецептуры в общем могут быть найдены в Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co. Истон, ПА.
Для системного введения предпочтительным является оральное введение. Альтернативно может быть использована инъекция, например внутримышечная, внутривенная, интраперитонеальная и подкожная. Для инъекции молекулы изобретения формулируют в жидкие растворы, предпочтительно в физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хенка или раствор Рингера. Кроме того, молекулы могут быть сформулированы в твердой форме и повторно растворены или суспендированы непосредственно перед использованием. Также включены лиофилизированные формы.
Системное введение также может быть через слизистую или через кожу, или молекулы могут быть введены орально. Для введения через слизистую или через кожу в рецептуре используют подходящие пенетранты, позволяющие перейти барьер. Такие пенетранты в общем известны на данном уровне техники и включают, например, для введения через слизистую желчные соли и производные фусидовой кислоты. Кроме того, могут быть использованы детергенты для облегчения проникновения. Введение через слизистую может быть осуществлено через аэрозоли для носа, например, или с использованием суппозиториев. Для орального введения молекулу формулируют в традиционные для орального введения формы, такие как капсулы, таблетки и тоники.
Для местного введения молекулы изобретения формулируют в виде мазей, бальзамов, гелей или кремов, как это является обычным на данном уровне техники.
Как показано в примерах ниже, количества различных соединений настоящего изобретения, которые должны быть введены, могут быть определены по стандартным методикам. Обычно это количество находится между 1 и 50 мг/кг животного, подлежащего лечению.
Рекомбинантные рецепторы
Скринирование природных продуктов традиционно обеспечивает ведущие структуры для разработки различных терапевтических молекул. Однако скринирование большого количества исходного материала из банков природных молекул или банков других молекул на активность по отношению к Ca2+-рецептору ранее было невозможно. Для достижения этой способности лучше всего клонировать кДНК Ca2+-рецептора, а затем создать трансфецированные клеточные линии, пригодные для скрининга с большим количеством исходного материала. Структура рецептора может быть дополнительно использована, чтобы понять молекулярную г