СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ЛИПИДОВ И КОМПЛЕКСА АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ
RU (11) 2066189 (13) C1
(51) 6 A61K35/50
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 17.09.2007 - прекратил действие
--------------------------------------------------------------------------------
(14) Дата публикации: 1996.09.10
(21) Регистрационный номер заявки: 93020003/14
(22) Дата подачи заявки: 1993.04.15
(45) Опубликовано: 1996.09.10
(56) Аналоги изобретения: Прототип в литературе не обнаружен.
(71) Имя заявителя: Морозова Р.П.; Ермолова Л.С.; Николенко И.А.; Мельников В.И.
(72) Имя изобретателя: Морозова Р.П.; Ермолова Л.С.; Николенко И.А.; Мельников В.И.
(73) Имя патентообладателя: Морозова Розалия Петровна; Ермолова Любовь Степановна
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ЛИПИДОВ И КОМПЛЕКСА АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ
Изобретение относится к биотехнологической промышленности, в частности к производству биологически активных веществ (БАВ) из сырья животного происхождения, а именно из плаценты сельскохозяйственных животных и человека. Способ заключается в том, что плаценту измельчают, экстракцию проводят (10-18)-кратным объемом хлороформа и этанола в соотношении 2 : 1, вводят (0,1-0,2)-кратный объем хлорида натрия до разделения на две фракции: хлороформную, из которой после упаривания выделяют комплекс БАВ липидной природы, и водно-спиртовую, из которой после упаривания и сушки, получают концентрат аминокислот и пептидов. 2 табл.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно к производству биологически активных веществ (БАВ) из сырья животного происхождения, а именно из плаценты сельскохозяйтсвенных животных и человека.
Плацента содержит очень важные ферменты, активирующие синтез белков, интенсифицирующие углеводный и липидный обмен, окислительно-восстановительные процессы. Планцента продуцирует целый ряд гормонов, в том числе экстрогены, оказывает существенное влияние на процессы роста. Плацента содержит жиро- и водорастворимые витамины, гистамин и ацетилхолин, фибрино- и фибриногенолитические ферменты. Является организм, обеспечивающим обмен мать и плод.
Известны способы получения различных белковых веществ (белковой природы) из плаценты, например: способ получения кислоторастворимого коллагена (1. Авторское свидетельство СССР N 1417454, C 07 K 3/02, 1998 г.). антикоагулянта (2. Патент США N 4873222, A 61 K 37/02, публ. 1991 г.), белков PP4, PP11, PP20, PP21), 3. Патент США N 4507229, A 61 K 35/50, публ. 1985 г. прототип: 4. Патент США N 4325866 (приоритет ФРГ, заявка N 2946438, 1979 г. A 61 K 39/395, публ. 1982 г. 5. Патент США N 4594328, A 61 K C 07 K 15/14, публ. 1985 г. 6. Заявка ЕПВ N 0141326, C 07 K 15/00, публ. 1984 г.), которые используются преимущественно как диагностикумы.
Преимущественное сходство этих способов заключается в осуществлении следующих операций: измельчение плаценты и выделение белковых препаратов путем экстракции, например раствором хлорида натрия и различными детергентами.
Общим недостатком известных аналогов является сложное, трудоемкое выделение из сырья, богатого на БАВ, только одного белкового препарата.
Белок PP4 имеет электрофоретическую подвижность в пределах между 1 и 2-глобулинами, изоэлектрическая точка 4,85 0,15, коэффициент седиментации 3,3 0,25; молекулярная масса в ПАГ с DS-Na - 35,000 5,000, коэффициент экстинкции E1см 1% (280 нм) 5,9 0,6, содержание углеводов 2,4 0,94 (г/100 г): манноза 0,3 0,2%) галактоза 0,4 0,2% ксилоза 0,1 0,4% глюкоза 0,2 0,1% глюкозамин 1,0 0,2% и нейраминовая кислота 0,4 0,2%
Получаемый белок со специфическим аминокислотным составом может быть использован для приготовления антисыворотки.
В основу изобретения поставлена задача получения комплексов БАВ из плаценты путем совершенствования схемы способа и подбора условий и режимов его отдельных операций.
Технический результат достигается за счет осуществления способа получения БАВ, в котором после измельчения плаценты экстракцию проводят (10-18)-кратным объемом хлороформа и этанола в соотношении 2:1, вводят (0,1-0,2)-кратным объемом хлорида натрия до разделения на две фракции: хлороформную, из которой выделяют после упаривания комплекс БАВ липидной природы, и водно-спиртовую, из которой после упаривания и сушки, получают концентрат аминокислот и пептидов.
Получаемые БАВ обладают широким диапазоном действия. Например: липидный комплекс, в составе которого (таблица 1) входят эфиры холестерина, этерифицированные и неэтерифицированные (свободные) жирные кислоты, C27 (холестерин и др.), С30 (ланомтерин) стерины. фосфолипиды с преимущественным содержанием фосфатидилхолина (лецитина), обладает регенериpующими и эмульгирующими свойствами, улучшает транспорт жиров в организме и может найти широкое применение в косметической и фармакологической промышленности.
Концентрат аминокислот (50%) в свободной виде и пептидов (50%) является уникальным, так как в известной информации подобного соотношения (1:1) пептидов и аминокислот не обнаружено.
Кроме того, этот концентрат содержит в свободном виде глютаминовую кислоту, тогда как в состав пептидов входят цистеин и метионин. Такой состав белкового концентрата обеспечивает регулирование азотистого обмена и окислительно-восстановительных реакций.
Сравнение нового способа и способа-прототипа (4. Патент США N 4325866) приоритет ФРГ, заявка N 2946433, 1979 г.) A 61 K 39/395, публ. 1982 г.) показывает, что сходство их заключается в использовании одного источника сырья плаценты, и использования при экстракции и получения фракций, содержащий БАВ, раствора хлорида натрия и реагентов.
Cведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения, представлены в примерах 1-3.
Пример 1. 1 кг плаценты сельскохозяйственных животных измельчают на мясорубке до получения частиц размером не более 1 мм и экстрагируют хлороформно-этанольной смесью (2: 1) в объемном соотношении 1:10 (cырье: смесь растворителей) при комнатной температуре и перемешивания в течение 1,5 час. Затем массу фильтруют через бязевый мешок на нутч-фильтре и промывают небольшими порциями той же смесью растворителей (0,2 объема в 3 раза по отношению к полученному объему).
К фильтрату прибавляют 0,2 объема 0,1% раствора хлорида натрия, перемешивают и отстаивают до полного просветления двух слоев жидкостей. Нижний хлороформенный слой сливают в выпарной аппарат через бязевый мешок, содержащий безводный Na2SO4 (1:10) и хлороформ удаляют в вакууме полностью. Полученный продукт коричневого цвета представляет собой комплекс липидов, легкоплавкий (t плавления 50o C.
Выход 10,0% от сухого веса сырья (таблица 1).
Водно-спиртовой слой помещают в выпарной аппарат и удаляют основную часть спирта в вакууме. Полученный раствор сушат, остаток порошок белковый комплекс кремового цвета, представляет собой концентрат аминокислот и пептидов (таблица 2). Кроме того, этот продукт содержит небольшое количество углеводов, фосфолипидов. Выход 9,0% от сухого веса сырья.
Пример 2. Способ осуществляют согласно схемы, описанной в примере 1, однако экстракцию проводят при объемном соотношении сырья к хлороформно-этанольной смеси 1:14, и в экстракт после фильтрации вводят 0,1 объема 0,15% раствора хлорида натрия.
Выход липидного комплекса составляет 11,3% от сухого веса сырья, выход концентрата аминокислот и пептидов 9,5% от сухого веса.
Пример 3. Способ осуществляют согласно схемы, описанной в примере, однако в качестве сырья используют плаценту человека, экстракцию проводят при объемном соотношении сырья к хлороформно-этанольной смеси 1:18, и в экстракт после фильтрации вводят 0,2 объема 0,12% раствора хлорида натрия.
Выход липидного комплекса составляет 12,0% от сухого веса сырья, выход концентрата аминокислот и пептидов 10,0%
Составы получаемых комплексов БАВ представлены в таблицах 1,2.
Выход липидного комплекса от исходного сырья (на сухой вес) составляет 10%
Основными фосфолиапидами являются: фосфоэтаноламин, составляющий 29,5% от общих фосфолипидов; фосфатилилхолин 56,9% остальные фосфолипиды являются минорными компонентами.
Фосфатилилхолин (лецитин), максимальное количество которого содержится в получаемом фосфолипидном комплексе, имеет широкое применение как поверхностно активное вещество. Поэтому можно считать, что роль биологически активных компонентов в основном принадлежит фракциям C27-стеринов, жирных кислот (свободных и связанных), а также фосфолипидов.
Исходя из приведенных данных, в препарате содержится пептидов и свободных аминокислот в соотношении 1:1. Глютаминовая кислота большей частью находится в свободном виде. В небольшом количестве содержатся гамма-аминомасляная кислота и орнитин. В состав пептидов входят цистеин и метионин. Такой набор аминокислот как в свободном виде, так и в составе пептидов наделяют препарат свойствами определенной биологической активности: поддержание азотистого баланса в организме, стимулирование роста и окислительно-восстановительных процессов, снижения процессов ожирения печени.
Выбор заявляемых условий объясняется следующими результатами экспериментов:
уменьшение объемного соотношения хлороформ-этанольной смеси к сырью, например (9:1), приводит к неполному извлечению БАВ из сырья 8,1%
выход концентрата аминокислот и пептидов 8,0% а увеличение объема хлороформ-этанольной смеси практически не отражается на выходе получаемых БАВ, поэтому нерентабельно;
уменьшение вводимого в отфильтрованный экстракт объема (0,1-кратный) раствора хлорида натрия не обеспечивает достаточного разделения двух фракций: хлороформной и водно-этанольной, а увеличение объема (0,2-кратный) приводит к излишнему содержанию хлоридов водно-спиртовой фракции;
при экстракции указанное конкретное соотношение хлороформа и этанола в смеси необходимо для проведения исчерпывающей экстракции и извлечения целевых продуктов.
Биологическую активность получаемых препаратов изучали при исследовании объема жиров на крысах весом 100 г, у которых вызывали ожирение печени ("жировую печень") кормлением их пищей, богатой жирами и бедной белками. Препараты вводили орально в соотношении 1:1 в количестве 0,1% к основному рациону. Установлено, что введение в организм животных получаемых препаратов как совместно, так и раздельно предохраняет их от накопления жира в печени. Таким образом, можно сделать вывод о липотропном действии этих препаратов.
Сопоставление нового способа и аналогов, а также исследование биологической активности конечных продуктов доказывает преимущество нового решения, которые заключаются в получении по предложенной несложной схеме биологически активных препаратов липидной и белковой природы широкого спектра с высоким выходом в отличие от аналогичных способов, где выделяют монопродукт в небольших количествах при осуществлении ряда узконаправленной специфичности трудоемких операций (имуносорбция).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения комплекса липидов и комплекса аминокислот и пептидов из плаценты, заключающийся в том, что плаценту измельчают, экстрагируют хлороформ-этанольной смесью (2:1) при объемном соотношении к сырью 1: ( 10-18), фильтруют, к фильтрату добавляют 0,1-0,2 объема раствора хлорида натрия, отстаивают до расслоения, нижний хлороформный слой, содержащий липидный комплекс, вакуумируют, верхний водно-спиртовой слой, содержащий комплекс аминокислот и пептидов, вакуумируют и сушат.
Независимый научно технический портал
На главную страницу раздела
