РАСТВОРЫ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ БОЛИ, ВОСПАЛЕНИЯ И РАЗРУШЕНИЯ ХРЯЩА
(51) МПК
A61K 38/08 (2006.01)
A61K 38/27 (2006.01)
A61K 38/30 (2006.01)
A61K 38/55 (2006.01)
A61K 45/06 (2006.01)
A61P 19/02 (2006.01)
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 17.09.2007 - действует
--------------------------------------------------------------------------------
Документ: В формате PDF
(14) Дата публикации: 2006.03.20
(21) Регистрационный номер заявки: 2002104495/14
(22) Дата подачи заявки: 2000.07.21
(30) Приоритетные данные: 60/144904 1999.07.21 US
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2000.07.21
(43) Дата публикации заявки: 2004.03.10
(45) Опубликовано: 2006.03.20
(56) Аналоги изобретения: RU 2112495 C1, 10.06.1998. RU 2109293 C1, 20.04.1998. RU 2125873 C1, 10.02.1999. WO 9926657 А, 03.06.1999. БЕРТРАН Г. КАТЦУНГ Базисная и клиническая фармакология. Пер. с англ., М.-СПб Бином-Невский Диалект, 1998, т.1, с.22-25, 28-32, 43-45.
(72) Имя изобретателя: ДЕМОПУЛОС Грегори А. (US); ПАЛМЕР Памела П. (US); ХЕРЦ Джеффри М. (US)
(73) Имя патентообладателя: ОМЕРОС КОРПОРЕЙШН (US)
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2002.02.21
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: US 00/19864 (21.07.2000)
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 01/07067 (01.02.2001)
(98) Адрес для переписки: 129010, Москва, ул. Б.Спасская, 25, стр.3, ООО "Городисский и Партнеры", Егоровой Г.Б.
(54) РАСТВОРЫ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ БОЛИ, ВОСПАЛЕНИЯ И РАЗРУШЕНИЯ ХРЯЩА
Изобретение относится к области медицины, в частности к лечебным растворам против воспаления, боли и разрушения хряща. Способы и растворы обеспечивает интеграцию и модуляцию противовоспалительных ответных реакций синовиоцитов и хондроцитов в зависимости от ввода аутокоидных или рецепторных систем нейромедиаторов внутри сустава. Для ингибирования разрушения хряща в сустав вводят растворы, включающие (а) терапевтически эффективное количество анаболического хондропротекторного агента, выбранного из группы, состоящей из агонистов интерлейкинов (IL), которые способствуют анаболическим процессам в хряще, членов надсемейства трансформирующего фактора роста-, включая агонисты TGF- и агонисты костных морфогенных белков, которые способствуют анаболическим процессам в хряще, инсулиноподобных факторов роста, которые способствуют анаболическим процессам в хряще, и факторов роста фибробластов, которые способствуют анаболическим процессам в хряще и (b) терапевтически эффективное количество ингибитора катаболизма хряща, выбранного из группы, состоящей из антагонистов IL-1-рецепторов, антагонистов TNF--рецепторов, специфических ингибиторов циклооксигеназы-2, ингибиторов синтазы окиси азота и ингибиторов ядерного фактора kB, ингибиторов матричных металлопротеиназ, молекул клеточной адгезии, включая агонисты интегринов и анатагонисты интегринов, антихемотаксических агентов, ингибиторов внутриклеточной передачи сигналов, включая ингибиторы протеинкиназы С и ингибиторы тирозиновых протеинкиназ, модуляторов внутриклеточных (белок-тиразин)-фосфатаз и ингибиторов SH2-доменов, которые ингибируют катаболизм хряща и раствор доставляют местно. 5 н. и 49 з.п. ф-лы, 30 табл., 9 ил.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к лечебным растворам и к способам лечения и, в частности, растворам против воспаления, против боли и против разрушения хряща и к способам их лечения.
II. ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Артроскопия представляет хирургическую процедуру, при которой камера, соединенная с отдаленным источником света и видеомонитором, вводится в анатомический сустав (например, колено, плечо и т.п.) через небольшой портальный разрез в коже и суставной капсуле. Через подобные портальные разрезы в сустав можно ввести хирургические инструменты, их применение регулируется артроскопической визуализацией. По мере совершенствования техники артроскопии возрастающее число оперативных процедур, ранее осуществлявшихся "открытым" хирургическим способом, в настоящее время можно проводить артроскопически. Подобные процедуры включают, например, частичную менискоэктомию и восстановление связок в колене, акромиопластику плеча и санации манжета поворота плеча и синовэктомию локтя. В результате расширения хирургических показаний и разработки артроскопов с небольшим диаметром также стала обычной артроскопия запястья и голеностопного сустава.
При каждой артроскопии физиологическая орошающая жидкость (т.е. обычный физиологический раствор или лактированный раствор Рингера) постоянно пропускается через сустав, расширяя суставную капсулу и удаляя хирургические остатки, обеспечивая тем самым более четкую визуализацию внутри сустава. В патенте США 4504493 Маршалла раскрывается изомолярный раствор глицерина в воде в качестве непроводящего и оптически чистого орошающего раствора для артроскопии. Обычные физиологические орошающие жидкости не обеспечивают обезболивающего, противовоспалительного эффектов и эффекта против разрушения хряща.
Облегчение боли и страданий у пациентов в послеоперационном периоде представляет область особого внимания в клинической медицине, особенно с возрастающим числом амбулаторных хирургических вмешательств, проводимых ежегодно. Наиболее широко применяемые системные средства, ингибиторы циклооксигеназы (например, ибупрофен) и опиоиды (например, морфин, фентанил) обладают существенными побочными эффектами, включая раздражение желудка и кишечника/кровотечение и угнетение дыхания. Высокая частота проявления тошноты и рвоты, связанная с опиоидами, является особенной проблемой в послеоперационном периоде. Терапевтические средства, направленные на облегчение боли в послеоперационном периоде, с одновременным отсутствием у них вредных побочных эффектов, трудно разработать в силу того, что молекулярные мишени для данных агентов широко распространены в организме и опосредуют различные физиологические функции. Несмотря на значительную клиническую потребность в подавлении боли и воспаления, а также разрушения хряща, не разработаны способы доставки ингибиторов боли, воспаления и разрушения хряща в эффективных дозировках, при сведении до минимума при этом побочных системных эффектов. В качестве примера, обычные (т.е. внутривенный, пероральный, подкожный или внутримышечный) способы введения опиатов в терапевтических дозах часто связаны со значительными побочными эффектами, включая сильное угнетение дыхания, изменения в настроении, помутнение сознания, тяжелую тошноту и рвоту.
В предыдущих исследованиях была показана способность эндогенных агентов, таких как серотонин (5-гидрокситриптамин, иногда называемый в описании как "5-НТ"), брадикинин и гистамин, вызывать боль и воспаление. Sicuteri F. et al., Serotonin-Bradykinin Potentiation in the Pain Receptors in Man, Life Sci. 4, pp.309-316 (1965); Rosenthal S.R., Histamine as the Chemical Mediator for Cutaneous Pain, J. Invest. Dermat. 69, pp.98-105 (1977); Richardson В.P. et. al., Identification of Serotonin M-Receptor Subtypes and their Specific Blockade by a New Class of Drugs, Nature 316, pp.126-131 (1985); Whalley E.T. et. al., The Effect of Kinin Agonists and Antagonists, Naunyn-Schmiedeb Arch. Pharmacol. 36, pp.652-57 (1987); Lang E. et. al., Chemo-Sensitivity of Fine Afferents from Rat Skin In Vitro, J. Neurophysiol. 63, pp.887-901 (1990).
Например, было показано, что 5-НТ, нанесенный человеку на кожу, покрытую волдырями (оголенную кожу), вызывает боль, которую можно подавлять антагонистами 5-НТ3-рецепторов: Richardson et. al., (1985). Аналогичным образом примененный в периферических тканях брадикинин вызывает боль, которую можно блокировать антагонистами брадикининовых рецепторов: Sicuteri et. al., 1965; Whalley et. al., 1987; Dray A. et. al., Bradykinin and Inflammatory Pain, Trends Neurosci. 16, pp.99-104 (1993). Примененный в периферических тканях гистамин вызывает расширение сосудов, зуд и боль, которые можно подавлять антагонистами гистаминовых рецепторов: Rosenthal, 1977; Douglas W.W., "Histamine and 5-Hydroxytryptamine (Serotonin) and their Antagonists", in Goodman L.S. et. al., ed. The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing Company, New York, pp.605-638 (1985); Rumore M.M. et. al., Analgesic Effects of Antihistaminics, Life Sci 36, pp.403-416 (1985). Было показано, что комбинации данных трех агонистов (5-НТ, брадикинина и гистамина), использованных вместе, проявляют синергетический вызывающий боль эффект, вызывая длительный и интенсивный болевой сигнал. Sicuteri et. al., 1965; Richardson et. al., 1985; Kessler W. et. al., "Excitation of Cutaneous Afferent Nerve Endings In Vitro by a Combination of Inflammatory Mediators and Conditioning Effect of Substance P", Exp. Brain Res. 91: 467-476 (1992).
В организме 5-НТ находится в тромбоцитах и центральных нейронах, гистамин обнаружен в тучных клетках, и брадикинин образуется из более крупных молекул-предшественников во время травмирования тканей, изменений рН и изменений температуры. Поскольку 5-НТ может высвобождаться в больших количествах из тромбоцитов в местах травмирования тканей, приводя к концентрациям в плазме, превышающим в 20 раз таковые в состоянии покоя (Ashton J.H. et. al., "Serotonin as a Mediator of Cyclic Flow Variations in Stenosed Canine Coronary Arteries", Circulation 73: 572-578 (1986), возможно, что эндогенный 5-НТ играет роль в возникновении в послеоперационном периоде боли, гипералгезии и воспаления. Фактически было показано, что активация тромбоцитов приводит к возбуждению периферических ноцирецепторов в условиях in vitro. Ringkamp M. et. al., 'Activated Human Platelets in Plasma Excite Nociceptors in Rat Skin, In Vitro", Neurosci. Lett. 170: 103-106 (1994). Аналогичным образом гистамин и брадикинин также высвобождаются в ткани во время травмы. Kimura E. et. al., "Changes in Bradykinin Level in Coronary Sinus Blood After the Experimental Occlusion of a Coronary Artery", Am. Heart J. 85: 635-647 (1973); Douglas, 1985; Dray et. al. (1993).
Кроме того, известно, что простагландины также вызывают боль и воспаление. Обычно ингибиторы циклооксигеназы, например, ибупрофен, применяются при нехирургических и послеоперационных вмешательствах в целях блокирования продукции простагландинов, тем самым уменьшая опосредуемые простагландинами боль и воспаление: Flower R.J. et, al., Analgesic-Antipyretics and Anti-Inflammatory Agents; Drugs Employed in the Treatment of Gout, in Goodman L.S. et. al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing Company, New York, pp. 674-715 (1985). Ингибиторы циклооксигеназы связаны с некоторыми побочными системными эффектами, когда применяются обычными способами. Например, индометацин или кеторолак обладает общепризнанными побочными эффектами со стороны желудочно-кишечного тракта и почек.
Как обсуждалось, 5-НТ, гистамин, брадикинин и простагландины вызывают боль и воспаление. Известны и/или обсуждаются в течение двух последних десятилетий различные рецепторы, через которые данные агенты опосредуют свое действие в периферических тканях. Большая часть исследований была проведена на крысах или на других моделях животных. Однако имеются различия в фармакологии и последовательностях рецепторов у человека и животных.
Кроме того, антагонисты данных медиаторов в настоящее время не применяются для купирования боли в послеоперационном периоде. Группу препаратов, называемых антагонистами поглощения 5-НТ и норепинефрина, которая включает амитриптилин, использовали перорально со средним успехом при состояниях хронической боли. Однако полагают, что механизмы состояний хронической и острой боли значительно различаются. Фактически в двух исследованиях при подавлении острой боли с периоперативным использованием амитриптилина было показано отсутствие ослабляющего боль действия у амитриптилина: Levine J.D. et. al., "Desipramine Enhances Opiate Postoperative Analgesia", Pain 27: 45-49 (1986); Kerrick J.M. et. al., "Low-Dose Amitriptyline as an Adjunct to Opioids for Postoperative Orthopedic Pain: a Placebo-Controlled Trial Period", Pain 52: 325-30 (1993). В обоих исследованиях препарат вводили перорально. Во втором исследовании отмечалось, что перорально введенный амитриптилин действительно вызывает пониженную общую чувствительность у пациентов в послеоперационном периоде, что может быть за счет аффинности препарата для многих аминных рецепторов в мозге.
Амитриптилин помимо блокирования поглощения 5-НТ и норепинефрина, является сильным антагонистом 5-НТ-рецепторов. Следовательно, отсутствие эффективности в ослаблении боли в послеоперационном периоде в двух ранее указанных исследованиях противоречит предположению о роли эндогенного 5-НТ в развитии острой боли. Имеется ряд причин в отношении отсутствия ослабления острой боли под действием амитриптилина в данных двух исследованиях. (1) В первом исследовании (Levine et. al., 1986) амитриптилин использовался перед операцией в течение одной недели до ночи непосредственно перед операцией в то время, как во втором исследовании (Kerrick et. al., 1993) амитриптилин использовался только в послеоперационном периоде. Следовательно, не известны уровень амитриптилина, имеющийся в тканях в месте операции во время стадии фактического травмирования тканей, и время, когда 5-НТ начинает высвобождаться. (2) Известно, что амитриптилин интенсивно метаболизируется в печени. При пероральном введении во втором исследовании концентрация амитриптилина в тканях в месте операции может быть не достаточно высокой в течение достаточно длительного периода времени для ингибирования активности высвобожденного 5-НТ в послеоперационном периоде. (3) Поскольку существуют многочисленные медиаторы воспаления, и в исследованиях было показан синергизм медиаторов воспаления, то блокирование только одного вещества (5-НТ) может ингибировать воспалительный ответ на травмирование тканей не в достаточной степени.
Имеется несколько исследований, в которых была показана способность антагонистов гистаминовых рецепторов в очень высоких концентрациях (1%-3% растворы, т.е. 10-30 мг на миллилитр) действовать в качестве местных анестетиков при хирургических процедурах. Полагают, что данное анестезирующее действие опосредуется не через Hi-рецепторы, а в большей степени за счет неспецифического взаимодействия с натриевыми каналами мембран нейронов (аналогично действию лидокаина). Оказывая побочные эффекты (например, седативный эффект), связанные с данными высокими "анестезирующими" концентрациями антагонистов гистаминовых рецепторов, местное применение антагонистов гистаминовых рецепторов в настоящее время не практикуется в периоперативном периоде.
III. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает раствор, включающий смесь многих агентов в низких концентрациях, предназначенный для местного ингибирования медиаторов боли, воспаления и разрушения хряща в физиологической, содержащей электролиты жидкости-носителе. Изобретение также обеспечивает способ периоперативной доставки орошающего раствора, содержащего данные агенты, непосредственно в место операции, где он действует местно на уровне рецепторов и ферментов для упреждающего подавления боли, воспаления и разрушения хряща в месте операции. За счет способа местной периоперативной доставки согласно настоящему изобретению, желаемый терапевтический эффект может быть достигнут при более низких дозах агентов, чем необходимые при применении других способов доставки (т.е. внутривенного, внутримышечного, подкожного и перорального). Агенты против боли, и/или против воспаления, и/или против разрушения хряща в растворе включают агенты, выбранные из следующих групп антагонистов и агонистов рецепторов и активаторов и ингибиторов ферментов, где каждая группа действует через различный молекулярный механизм подавления боли, и/или воспаления, и/или разрушения хряща. Типичные агенты для подавления боли и/или воспаления включают, например: (1) антагонисты серотониновых рецепторов; (2) агонисты серотониновых рецепторов; (3) антагонисты гистаминовых рецепторов; (4) антагонисты брадикининовых рецепторов; (5) ингибиторы калликреина; (6) антагонисты тахикининовых рецепторов, включая антагонисты подтипов рецепторов нейрокинина1 и нейрокинина2; (7) антагонисты рецепторов пептида, связанного с геном кальцитонина (CGRP); (8) антагонисты интерлейкиновых рецепторов; (9) ингибиторы ферментов, активных в синтезе метаболитов арахидоновой кислоты, включая (а) ингибиторы фосфолипаз, в том числе ингибиторы изоформы PLA 2 и ингибиторы изоформы PLC; (b) ингибиторы циклооксигеназы и (с) ингибиторы липооксигеназы; (10) антагонисты простаноидных рецепторов, включая антагонисты подтипа рецепторов эйкозаноида ЕР-1 и ЕР-4 и антагонисты подтипа рецепторов тромбоксана; (11) антагонисты лейкотриеновых рецепторов, включая антагонисты подтипа рецепторов лейкотриена D4 и антагонисты подтипа рецепторов лейкотриена D4; (12) агонисты опиоидных рецепторов, включая агонисты подтипов рецепторов -опиоида, -опиоида и -опиоида; (13) антагонисты пуриноцепторов, включая антагонисты рецепторов Р2X и антагонисты рецепторов Р2Y; (14) антагонисты кальциевых каналов. Каждый из вышеуказанных агентов функционирует в качестве либо агента против воспаления, либо против чувствительности, т.е. против боли, или анальгезирующего агента. Выбор агентов из данных групп соединений обусловлен конкретным применением. Типичные агенты для подавления разрушения хряща включают, например: (1) антагонисты рецепторов семейства белков интерлейкина-1, включая, например, IL-1, IL-17 и IL-18; (2) антагонисты семейства рецепторов факторов некроза опухолей (TNF), например TNF-R1; (3) агонисты рецепторов интерлейкина 4, 10 и 13; (4) агонисты надсемейства рецепторов TGF-, включая, например, BMP-2, BMP-4 и ВМР-7; (5) ингибиторы СОХ-2; (6) ингибиторы семейства МАР-киназ, включая, например, р38 МАРкиназу; (7) ингибиторы семейства белков матричных металлопротеиназ (ММР), включая, например, ММР-3 и ММР-9; (8) ингибиторы семейства белков NF-В, включая, например, димерный комплекс р50/р65 с IВ; (9) ингибиторы семейства синтазы окиси азота (NOS), включая, например, iNOS; (10) агонисты и антагонисты интегриновых рецепторов, включая, например, агонисты V 3-интегрина; (11) ингибиторы семейства протеинкиназы С (РКС); (12) ингибиторы семейства тирозиновых протеинкиназ, включая, например, подсемейство src; (13) модуляторы (белок-тирозин)-фосфатаз; и (14) ингибиторы доменов гомологии 2 белков scr (SH2).
В других аспектах изобретения обеспечиваются способы и растворы для подавления или предупреждения разрушения суставного хряща введением непосредственно в сустав пациента композиции, которая включает один или более метаболически активных защитных для хряща агентов вместе с одним или более агентами для подавления боли, воспаления или тому подобное, как описано ранее, или альтернативно комбинации двух или более метаболически активных защитных для хряща агентов в фармацевтически эффективном носителе для внутрисуставной доставки. Метаболически активные агенты включают, но не ограничиваются соединениями, которые действуют непосредственно или опосредованно для модуляции или изменения биологического, биохимического или биофизического состояния клетки, включая агенты, которые изменяют электрический потенциал плазменной мембраны, активность связывания лиганда или ферментативную активность клеточных рецепторов, внутриклеточных или внеклеточных ферментов, взаимодействия белок-белок, взаимодействия РНК-белок или взаимодействия ДНК-белок. В одном аспекте настоящего изобретения обеспечиваются фармацевтические композиции метаболически активных защитных для хряща агентов, которые основаны на комбинации по меньшей мере двух агентов, которые действуют одновременно на различные молекулярные мишени. В типичном воплощении по меньшей мере один агент является агонистом рецепторов цитокинов или факторов роста, которые непосредственно обеспечивают противовоспалительную активность и/или способствуют анаболическим процессам в хряще, и по меньшей мере второй агент представляет антагонист рецепторов или ингибитор ферментов, который действует для подавления воспалительных и/или катаболических процессов в хряще. Противовоспалительные/анаболические цитокины, которые действуют функционально для подавления роли провоспалительных цитокинов в суставе, способствуют синтезу хрящевого матрикса и подавляют разрешение матрикса. Данные агонисты рецепторов включают, например, специфические противовоспалительные и анаболические цитокины, такие как агонисты интерлейкинов (IL) (например, IL-4, IL-10 и IL-13), и специфические члены подсемейства трансформирующего фактор роста- (например, TGF и ВМР-7), инсулиноподобные факторы роста (например, IGF-1) и факторы роста фибробластов (например, bFGF). По меньшей мере второй агент выбран из группы антагонистов рецепторов или ингибиторов ферментов, который действует для подавления или снижения активности, или экспрессии провоспалительной молекулярной мишени (например, антагонисты IL-1-рецепторов, антагонисты TNF--рецепторов, ингибиторы циклооксигеназы-2, ингибиторы МАРкиназы, ингибиторы синтазы окиси азота (NOS) и ингибиторы ядерного фактора kappaB (NF-В). Множественная комбинация агентов из анаболических агентов и ингибиторов катаболизма может добавляться местно путем внутрисуставной инъекции или инфузии, включая периоперативное назначение (т.е. перед операцией и/или во время операции и/или после операции) во время хирургических артроскопических процедур.
Суставной хрящ представляет специализированный внеклеточный матрикс, который продуцируется и сохраняется метаболически активными суставными хондроцитами. Сохранение нормального, здорового внеклеточного матрикса отражает динамический баланс между скоростью биосинтеза и включением матричных компонентов и скоростью их разрушения и последующей потери из хряща в синовиальную жидкость. Несмотря на то, что регуляторные механизмы, которые лежат в основе гомеостаза в матриксе, не совсем еще хорошо понятны, они четко изменяются при воспалительных заболеваниях суставов и в ответ на травму суставов так, что скорость распада матрикса превышает скорость нового синтеза матричных компонентов. Гомеостаз в матриксе обычно рассматривается, как динамический баланс между катаболическими цитокинами и анаболическими цитокинами (включая факторы роста). Оптимальная комбинация терапевтических агентов, подходящих для защиты хряща, сдвигает динамическое равновесие в матриксе, ускоряя скорость синтеза и одновременно ингибируя скорость распада, таким образом делая максимальными анаболические процессы и способствуя восстановлению хряща.
Катаболические цитокины, такие как IL-1 и TNF-, действуют на специфические рецепторы хондроцитов, индуцируя продукцию MMPs, которые индуцируют распад матрикса, в то время как разрушение ингибируется анаболическими цитокинами, такими как TGF-, ВМР-2 и IGF-1. Следовательно, терапевтический подход, базирующийся только на ингибировании катаболических процессов (такой, как композиция ингибитора ММР и антагониста IL-1), не является оптимальным для восстановления хряща, поскольку необходимы анаболические агенты для индукции или ускорения биосинтеза и сборки компонентов для продукции матрикса. Второе, множество катаболических цитокинов (IL-1, TNF, IL-17, IL-18, LIF), которые участвуют в деструкции хрящевого матрикса, указывает, что будет непрактичным полностью блокировать катаболическую активность цитокинов. И наоборот, подход, который основывается только на использовании анаболических агентов таких, как IGF-1, BMP-2 или BMP-7, не является оптимальным, поскольку он не направлен на противорегуляторную роль катаболических цитокинов. TGF-, ВМР-2 и IGF-1 также действуют на специфические рецепторы с индукцией хондроцитов продуцировать компоненты матрикса, которая тормозится под действием IL-1, TNF-, IL-17 и LIF. Следовательно, оптимальная терапевтическая комбинация для защиты хряща состоит из по меньшей мере одного анаболического агента и одного ингибитора катаболизма хряща.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения лекарственного препарата, составленного в виде разбавленного орошающего раствора для использования при постоянном орошении места операции, обычно в месте сустава у пациента во время артроскопической хирургической процедуры. Способ включает растворение в физиологической, содержащей электролиты жидкости-носителе по меньшей мере одного агента против разрушения хряща и предпочтительно одного или более агентов ингибирующих боль/воспаления и для некоторых применений агентов против разрушения хряща, где каждый агент включен в концентрации предпочтительно не более чем 100000 нмоль, более предпочтительно не более чем примерно 25000 нмоль, и наиболее предпочтительно не более чем примерно 10000 нмоль.
Способ по настоящему изобретению обеспечивает доставку разбавленной комбинации многочисленных антагонистов и агонистов рецепторов и ингибиторов и активаторов ферментов непосредственно на рану или место операции во время терапевтических или диагностических процедур для подавления боли, воспаления и разрушения хряща. Поскольку активные ингредиенты в растворе применяются местно непосредственно на ткани в месте операции в течение постоянного периода времени, препараты можно эффективно использовать в очень низких дозах по сравнению с дозами, необходимыми для проявления терапевтического эффекта, когда те же препараты доставляются перорально, внутримышечно, подкожно или внутривенно. В том смысле, как он используется, термин "местный" включает применение препарата в или вокруг раны или другого места операции, и исключает пероральное, подкожное, внутривенное и внутримышечное введение. Термин "постоянный", в том смысле, как он используется, включает непрерывное применение, неоднократное применение с частыми интервалами, и применения, которые являются непрерывными за исключением коротких остановок, позволяющих ввести другие препараты, или агенты, или оборудование для процедуры, таким образом, что в основном постоянная, заранее определенная концентрация сохраняется местно в ране или месте операции.
Преимущества применения агентов в низких дозах являются троекратными. Наиболее важным является отсутствие системных побочных эффектов, которые часто ограничивают полезность данных агентов. Кроме того, агенты, выбранные для особых применений в растворах по настоящему изобретению, являются высоко специфичными в отношении медиаторов и опосредующих мишеней, на которые они действуют. Данная специфичность поддерживается используемыми низкими дозами. Наконец, стоимость данных активных агентов для хирургической процедуры является низкой.
Преимущества местного применения агентов путем орошения или другого применения жидкости являются следующими: (1) местное применение гарантирует наличие известной концентрации в целевом месте, независимо от вариабельности между пациентами в метаболизме, кровяном потоке и т.п.; (2) в результате прямого способа доставки терапевтическую концентрацию получают незамедлительно и, таким образом, обеспечивается усовершенствованный контроль дозирования; и (3) также местное применение активных агентов непосредственно на рану или место операции существенно снижает деградацию агентов в системных процессах, например, в результате первичного и вторичного метаболизма, что в противном случае будет иметь место, когда агенты вводят перорально, внутривенно, подкожно или внутримышечно. Это особенно касается тех активных агентов, которые по своей природе являются пептидами, которые быстро метаболизируются. Таким образом, местное применение позволяет использовать соединения или агенты, которые в противном случае нельзя использовать в терапевтических целях. Например, некоторые агенты в следующих группах являются пептидами; антагонисты брадикининовых рецепторов; антагонисты тахикининовых рецепторов; агонисты опиоидных рецепторов; антагонисты CGRP-рецепторов; и антагонисты интерлейкиновых рецепторов; антагонисты TNF-рецепторов; агонисты TGF--рецепторов; агонисты ВМР-2- и ВМР-7-рецепторов; агонисты рецепторов IL-4, IL-10 и IL-13; агонисты и антагонисты интегриновых рецепторов. Местная, постоянная доставка на рану или место операции сводит до минимума деградацию или метаболиз препаратов, в то же время обеспечивая постоянную замену той порции агента, которая может деградировать, для гарантии того, что местная, терапевтическая концентрация, достаточная для поддержания занятости рецептора или насыщения фермента, поддерживается во время всего периода хирургической процедуры.
Местное периоперативное применение раствора во время хирургической процедуры по настоящему изобретению дает упреждающий обезболивающий, противовоспалительный и защитный в отношении хряща эффект. В том смысле, как он используется, термин "периоперативный" включает применение во время процедуры, перед и во время процедуры, во время и после процедуры, и перед, во время и после процедуры. Для максимального проявления упреждающего противовоспалительного, обезболивающего (для некоторых применений) и защитного для хряща (для некоторых применений) действия растворы по настоящему изобретению наиболее предпочтительно применяют перед, во время и после операции. Занимая целевые рецепторы или инактивируя или активируя целевые ферменты до начала значительного местного травмирования во время операции агенты настоящего раствора модулируют специфические пути для упреждающего подавления целевого патологического процесса. Если медиаторы или процессы воспаления упреждающе подавляются по настоящему изобретению до того, как они могут вызвать повреждение ткани, польза является более существенной, чем, если она предоставляется после того, как повреждение уже началось.
Было показано, что ингибируя более чем один медиатор боли, воспаления или разрушения хряща, применением раствора из многих агентов по настоящему изобретению, наглядно снижается степень воспаления и боли, и теоретически будет обеспечиваться защитное действие в отношении хряща. Орошающие растворы по настоящему изобретению включают комбинации препаратов, где каждый раствор действует на многочисленные рецепторы или ферменты. Таким образом, лекарственные агенты являются одновременно эффективными против целой комбинации патологических процессов, включая боль и воспаление и потерю гомеостаза в хряще. Полагается, что действие данных агентов является синергетическим, а именно многие антагонисты рецепторов и ингибирующие агонисты по настоящему изобретению обеспечивают в комбинации диспропорционально повышенную эффективность по сравнению с эффективностью отдельных агентов. Синергетическое действие нескольких агентов по настоящему изобретению обсуждается с помощью примера ниже при подробном описании данных агентов.
Используемый периоперативно, раствор приводит к клинически заметному подавлению боли и воспаления в месте операции и разрушения хряща по сравнению с используемыми в настоящее время орошающими жидкостями, тем самым снижая потребность пациентов в анестетиках в послеоперационном периоде (т.е. опиате), и соответственно, позволяя проводить более раннюю мобилизацию места операции у пациента. Со стороны хирурга и персонала операционной не требуется дополнительных усилий для применения настоящего раствора по сравнению с обычными орошающими жидкостями. Для оптимальной защиты хряща растворы по изобретению применяются непосредственно на сустав перед, во время и/или после хирургической процедуры.
IV. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Настоящее изобретение будет подробнее описано с помощью примеров со ссылкой на сопровождающие чертежи, где:
Фигура 1 представляет схематичный вид хондроцита, показывающий молекулярные мишени и поток сигнальной информации, приводящей к продукции медиаторов воспаления и сдвигам в метаболизме хряща. Показано, что интеграция внешних сигналов посредством нескольких семейств клеточных поверхностных рецепторов, включая цитокиновые рецепторы, такие как семейство рецепторов интерлейкина-1 (IL-1) и семейство рецепторов фактора некроза опухолей (TNF), надсемейство TGF--рецепторов и интегрины, сходятся на общих внутриклеточных путях передачи сигналов, которые включают большие группы белковых молекул, являющихся терапевтическими мишенями для препаратов, включенных в растворы по настоящему изобретению (МАРкиназы, РКС, тирозинкиназы, SH2-белки, СОХ, PLA2 и NF-6B). Активация данных путей передачи сигналов регулирует экспрессию в хондроцитах ряда индуцируемых генных продуктов, включая IL-1, TNF-, IL-6, IL-8 и стромелизин (ММР-3) и другие медиаторы (окись азота (NO) и PGE2), которые могут привести к воспалению и/или разрушению хряща, или синтезу матричных молекул и пролиферации хондроцитов.
Фигура 2 представляет схематичный вид синовиоцита, показывающий молекулярные мишени и поток сигнальной информации, приводящей к продукции медиаторов воспаления и сдвигам в метаболизме хряща. Показано, что интеграция внешних сигналов посредством нескольких семейств клеточных поверхностных рецепторов, включая цитокиновые рецепторы, которые включают семейство рецепторов интерлейкина-1 (IL-1) и семейство рецепторов фактора некроза опухолей (TNF), сопряженные с G-белком рецепторы, которые включают брадикининовые, гистаминовые и серотониновые подтипы, и интегрины, сходятся на общих внутриклеточных путях передачи сигналов, которые включают большие группы белковых молекул, являющихся терапевтическими мишенями для препаратов, включенных в растворы по настоящему изобретению (МАР-киназы, РКС, тирозинкиназы, SH2-белки, СОХ, PLA2 и NF-6B). Активация данных путей передачи сигналов регулирует экспрессию в синовиоцитах ряда индуцируемых генных продуктов, включая IL-1, TNF-, IL-6, IL-8 и стромелизин (ММР-3), которые могут привести к воспалению и/или разрушению хряща.
Фигура 3 представляет диаграмму общих путей передачи сигналов в хондроцитах и синовиоцитах, включая ключевые сигнальные белки, ответственные за "перекрестное влияние" между активированными GPCR-рецепторными путями и провоспалительными цитокиновыми путями, которые приводят к воспалению и разрушению хряща.
Фигура 4 представляет диаграмму общих путей передачи сигналов в хондроцитах и синовиоцитах, включая ключевые сигнальные белки, ответственные за "перекрестное влияние" между активированными GPCR-рецепторными путями и провоспалительными цитокиновыми путями. Указаны специфические молекулярные сайты действия некоторых лекарственных препаратов в предпочтительном защитном для хряща растворе по настоящему изобретению.
Фигура 5 представляет диаграмму молекулярных мишеней, находящихся либо на хондроцитах, либо на синовиоцитах, которые способствуют анаболическому ответу в хряще. Указаны специфические сайты действия некоторых лекарственных препаратов в предпочтительном защитном для хряща растворе по настоящему изобретению.
Фигура 6 представляет диаграмму молекулярных мишеней, находящихся либо на хондроцитах, либо на синовиоцитах, которые способствуют катаболическому ответу в хряще. Указаны специфические сайты действия некоторых лекарственных препаратов в предпочтительном растворе для защиты хряща по настоящему изобретению.
Фигура 7 представляет графическое изображение продукции простагландина Е2 в культурах синовиоцитов регуляторными агонистами G-белка с последующим премированием в течение ночи интерлейкином-1 (IL-1, 10 Е/мл). Культуры стимулировали в течение указанных периодов времени гистамином (100 мкМ, незакрашенные столбцы) или брадикинином (1 мкМ, закрашенные столбцы) и определяли высвобождаемый в культуральный супернатант простагландин Е2, как описано в примере 6. Представленные значения представляют среднее значение±стандартное отклонение в типичном опыте и с поправкой на фоновую продукцию простагландина Е2 в не стимулированных культурах.
Фигура 8 представляет графическое изображение ингибирования продукции простагландина Е2 в синовиальных культурах под действием кетопрофена. Культуры примировали в течение ночи IL-1 (10 Е/мл) в присутствии (показано, как ) или отсутствии (показано, как "" или "") кетопрофена в указанных концентрациях. Через один день определяли простагландин Е2 в супернатантах культур, обработанных в течение ночи кетопрофеном, и оставшиеся культуры промывали, инкубировали в течение 10 мин с кетопрофеном в указанных концентрациях, и затем определяли продукцию простагландина Е2 в ответ на последующую стимуляцию гистамином в течение 3 мин (100 мкМ, ) или брадикинином (1 мкМ, ) в продолжающемся присутствии кетопрофена в указанных количествах. Представленные данные нормализованы по отношению к максимальному ответу, полученному для каждого агониста соответственно, и представляют среднее значение ± стандартное отклонение, полученное в трех опытах, проведенных на различных клеточных линиях.
Фигура 9 представляет графическое изображение действия кетопрофена на продукцию IL-6 в синовиальных культурах на 16 ч в присутствии IL-1 в указанных концентрациях плюс добавленные лиганды рецепторов, сопряженные с G-белком. Культуры инкубировали в течение 16 ч с IL-1 в указанных концентрациях (0,3, 1,0 и 3,0 пг/мл) в отсутствии и присутствии 0/75 мкМ кетопрофена в экспериментальной культуральной среде с одним из следующих дополнительных рецепторных лигандов: 1) изопротеренолом (ISO) в концентрации 1,0 мкМ для активации общего пути или 2) гистамином (HIS) в концентрации 100 мкМ для активации IР3/кальциевого пути. Собирали культуральные супернатанты и замещали аликвотами свежей среды, содержащей добавки тех же агонистов с 8-часовыми интервалами. После обработки собирали супернатанты среды, соответствующие интервалам обработки от 8 до 16 ч, и анализировали на содержание IL-6.
V. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА
ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Орошающие и инъекционные растворы по настоящему изобретению представляют растворы одного или более агентов для защиты хряща агентов и необязательно одного или более обезболивающих и/или противовоспалительных агентов в физиологическом носителе. Носитель является жидким раствором, который предназначен для включения биосовместимых растворителей, суспензий, полимеризующихся и неполимеризующихся гелей, паст и мазей, а также компонентов систем доставки с постоянным высвобождением, таких как микрочастицы, микросферы или наночастицы, состоящие из белков, липосом, углеводородов, синтетических органических соединений или неорганических соединений. Предпочтительно носитель представляет водный раствор, который может включать физиологические электролиты, такой как обычный физиологический раствор или лактированный раствор Рингера.
Агенты против воспаления и/или боли выбраны из группы, состоящей из (1) антагонистов, серотониновых рецепторов; (2) агонистов серотониновых рецепторов; (3) антагонистов гистаминовых рецепторов; (4) антагонистов брадикининовых рецепторов; (5) ингибиторов калликреина; (6) антагонистов тахикининовых рецепторов, включая антагонисты подтипов рецепторов нейрокинина1 и нейрокинина 2; (7) антагонистов рецепторов пептида, связанного с геном кальцитонина (CGRP); (8) антагонистов интерлейкиновых рецепторов; (9) ингибиторов ферментов, активных в синтезе метаболитов арахидоновой кислоты, в том числе (а) ингибиторы фосфолипазы, включая ингибиторы изоформы PLA2 и ингибиторы изоформы PLC; (b) ингибиторы циклооксигеназы и (с) ингибиторы липооксигеназы; (10) антагонистов простаноидных рецепторов, включая антагонисты подтипа рецепторов эйкозаноида ЕР-1 и ЕР-4 и антагонисты подтипа рецепторов тромбоксана; (11) антагонистов лейкотриеновых рецепторов, включая антагонисты подтипа рецепторов лейкотриена В4 и подтипа рецепторов лейкотриена D4; (12) агонистов опиоидных рецепторов, включая агонисты рецепторов подтипа -опиоида, -опиоида и -опиоида; (13) агонистов и антагонистов пуриноцепторов, включая антагонисты рецепторов Р2X и антагонисты рецепторов P2Y ; (14) антагонистов кальциевых каналов.
Подходящие защитные для хряща агенты включают, например, (1) антагонисты рецепторов семейства белков интерлейкинов-1, включая, например, IL-1, IL-17 и IL-18; (2) антагонисты семейства рецепторов факторов некроза опухолей (TNF), включая, например, TNF-R1; (3) агонисты рецепторов интерлейкина 4, 10 и 13; (4) агонисты надсемейства рецепторов TGF-P, включая, например, BMP-2, BMP-4 и BMP-7; (5) ингибиторы COX-2; (6) ингибиторы семейства МАР-киназы, включая, например, р38 МАРкиназу; (7) ингибиторы семейства белков матричных металлопротеиназ (ММР), включая, например, ММР-3 и ММР-9; (8) ингибиторы семейства белков NF-кВ, включая, например, димерный комплекс р50/р65 с 1кВ; (9) ингибиторы семейства синтазы окиси азота (NOS), включая, например, iNOS; (10) агонисты и антагонисты интегриновых рецепторов, включая, например, агонисты V 3-интегрина; (11) ингибиторы семейства протеинкиназы С (РКС); (12) ингибиторы семейства тирозиновых протеинкиназ, включая, например, подсемейство src; (13) модуляторы протеин-тирозинфосфатаз; и (14) ингибиторы доменов гомологии-2 белков scr (SH2).
Специфические предпочтительные воплощения раствора по настоящему изобретению для использования для защиты хряща при артроскопических процедурах предпочтительно включают комбинацию агентов, которые действуют одновременно на различные молекулярные мишени для способствования анаболизму хряща и ингибирования нерегулируемых или избыточных катаболических процессов в хряще для достижения максимального ингибирования воспалительных процессов и сохранения гомеостаза в хряще, тем самым достигая защитное для хряща действие в суставе.
В каждом из хирургических растворов по настоящему изобретению агенты включены в низких концентрациях в жидком растворе или жидкой среде, и доставляются местно в низких дозах по сравнению с концентрациями и дозами, необходимыми при обычных способах введения лекарственных препаратов для достижения желаемого терапевтического эффекта. В том смысле, как он здесь используется, термин "жидкость" или "жидкая среда" предназначен для включения фармацевтически приемлемых, био совместимых растворителей, суспензий, полимеризуемых и неполимеризуемых гелей, паст и мазей. Предпочтительно носитель представляет водный раствор, который может включать физиологические электролиты такие, как обычный физиологический раствор или лактированный раствор Рингера. Представляется не возможным или непрактичным получить такой же терапевтический эффект при доставке агентов в таких же дозах другими (т.е. внутривенным, подкожным, внутримышечным или пероральным) путями введения лекарственных препаратов, поскольку лекарственные препараты, введенные системно подвергаются первичному и вторичному метаболизму. Концентрацию каждого агента отчасти определяют, ориентируясь на его константу диссоциации с рецептором, Kd, или константу ингибирования фермента, Ki . В том смысле, как он здесь используется, термин константа диссоциации предназначен включать константу равновесия диссоциации в отношении его типичного взаимодействия агонист-рецептор или антагонист-рецептор и константу равновесия ингибирования в отношении его типичного взаимодействия активатор-фермент или ингибитор-фермент. Каждый агент предпочтительно включен в низкой концентрации от 0,1 до 10000 раз от Kd или Ki, за исключением ингибиторов циклооксигеназы, для которой, возможно, требуются большие концентрации в зависимости от конкретного выбранного ингибитора. Предпочтительно каждый агент включен в концентрации от 1,0 до 1000 раз от Kd или Ki и наиболее предпочтительно 100 раз от Kd или Ki. Данные концентрации доводят при необходимости с учетом разбавления в отсутствии метаболической трансформации в месте локальной доставки. Конкретные агенты, выбранные для использования в растворе, и концентрации агентов варьируют в зависимости от конкретного применения, как описано ниже.
Раствор по настоящему изобретению может включать один или много агентов для подавления боли и/или воспаления, множественный защитный для хряща агент(ов), по меньшей мере один из которых является анаболическим защитным для хряща агентом, и по меньшей мере один из которых является ингибитором катаболизма хряща, или комбинацию защитного для хряща агента (ов) и агентов для подавления боли и/или воспаления в низкой концентрации. Однако за счет вышеуказанного синергетического действия многих агентов и желания полностью блокировать боль, воспаление и разрешение хряща, предпочтительно, чтобы использовались многие агенты.
Хирургические растворы представляют новый терапевтический подход при объединении многих фармакологических агентов, действующих на различные рецепторные и/или ферментные молекулярные мишени. К настоящему времени фармакологические стратегии сосредоточены на разработке высокоспецифичных лекарственных препаратов, которые являются селективными в отношении отдельных подтипов рецепторов и изоформ ферментов, которые опосредуют ответы на отдельные сигнальные нейромедиаторы и гормоны. Кроме того, несмотря на инактивирование одного подтипа рецептора или фермента, активация других подтипов рецептора или фермента и полученная сигнальная трансдукция часто может "запускать" каскадный эффект. Это объясняет значительную трудность при использовании одного лекарственного препарата, специфичного к одному рецептору для блокирования патофизиологического процесса, в котором играют роль многие сигнальные медиаторы (например, цитокины, факторы роста или эйкозаноиды). Следовательно, целенаправленное воздействие только на специфический отдельный подтип рецептора или изотип, вероятно, является неэффективным.
В противоположность обычному подходу к фармакологической терапии терапевтический подход с настоящими хирургическими растворами основан на рациональной основе, что комбинация лекарственных препаратов, действующих одновременно на различные молекулярные мишени, является высокоэффективным в отношении ингибирования полного спектра событий, которые лежат в основе развития патофизиологического состояния. Кроме того, вместо целенаправленного воздействия только на один специфический подтип рецепторов, хирургические растворы состоят из лекарственных препаратов, которые направлены на общие молекулярные механизмы, действующие в различных клеточных физиологических процессах, участвующих в развитии боли, воспаления или разрушения хряща (см. фигуру 1). Таким же образом каскад дополнительных рецепторов и ферментов в ноцицепторных, воспалительных и путях разрушения хряща сводится до минимума хирургическими растворами. В данных патофизиологических путях хирургические растворы ингибируют каскадный эффект "положительной регуляции" и "отрицательной регуляции".
Примером ингибирования по типу "положительной регуляции" являются антагонисты циклооксигеназы в подавлении боли и воспаления. Циклооксигеназы (COX2 и СОХ 2) катализируют превращение арахидоновой кислоты в простагландин Н, который представляет промежуточный продукт в биосинтезе воспалительных и ноцицептивных медиаторов, включая простагландины, лейкотриены и тромбоксаны. Ингибиторы циклооксигеназы блокируют "положительную регуляцию" образования данных медиаторов воспаления и ноцицепторов. Данная стратегия предусматривает необходимость блокирования взаимодействий семи описанных подтипов простаноидных рецепторов с простаноидными продуктами на биохимическом пути с участием СОХ. Подобный ингибитор "положительной регуляции", включенный в хирургические растворы, представляет апротинин, ингибитор калликреина. Фермент калликреин, серинпротеаза, расщепляет высокомолекулярные кининогены в плазме с образованием брадикининов, важных медиаторов боли и воспаления. Ингибируя калликреин, апротинин эффективно ингибирует синтез брадикининов, тем самым обеспечивая эффективное ингибирование "положительной регуляции" данных медиаторов воспаления.
В хирургических растворах также используются ингибиторы "отрицательной регуляции" для регуляции патофизиологических путей. В препаратах синовиоцитов и хондроцитов, которые были обработаны различными цитокинами воспаления (например, IL-1 и TNF-), участвующими в прогрессирующем разрушении суставного хряща, ингибиторы МАРкиназы представляют защитный эффект для хряща. р38 МАРкиназа представляет точку передачи в путях передачи сигналов для многих катаболических цитокинов, и ее ингибирование предупреждает "положительную регуляцию" многих клеточных продуктов, опосредующих разрушение хряща. Ингибиторы МАРкиназы, следовательно, обеспечивают значительное преимущество для хирургических растворов в подавлении воспаления суставов обеспечением "отрицательной регуляции" защитных эффектов для хряща, которые являются независимыми от физиологической комбинации агонистов цитокиновых рецепторов, индуцируя сдвиг гомеостаза в хряще.
Последующее представляет описание подходящих препаратов, попадающих в вышеуказанные группы агентов против воспаления/против боли и для защиты хряща, а также подходящие концентрации для применения в растворах по настоящему изобретению. Не желая ограничивать себя теорией, также приводится обоснование выбора различных групп агентов, которое, как полагается, делает агенты действующими.
I. ОБЕЗБОЛИВАЮЩИЕ И/ИЛИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ АГЕНТЫ
1. АНТАГОНИСТЫ СЕРОТОНИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Полагают, что серотонин (5-НТ) приводит к боли, стимулируя рецепторы серотонина 2 (5-НТ2) и/или серотонина3 (5-НТ3) на чувствительных периферических нейронах. Большинство исследователей едины во мнении, что 5-НТ3 -рецепторы на периферических ноцицепторах опосредуют мгновенное болевое ощущение, продуцированное 5-НТ (Richardson et al., 1985). Кроме того, ингибируя индуцированную 5-НТ боль антагонисты 5-НТ 3-рецепторов, ингибируя активацию ноцицепторов, также могут ингибировать нейрогенное воспаление. Barnes P.J. et al., Modulation of Neurogenic Inflammation: Novel Approaches to Inflammatory Disease, Trends in Pharmacological Sciences 11, pp. 185-189 (1990). Исследование на локтевых суставах крыс, однако, свидетельствует о том, что 5-НТ2-рецептор ответственен за активацию ноцицепторов под действием 5-НТ. Grubb B.D. et al., A Study of 5-HT-Receptors Associated with Afferent Nerves Located in Normal and Inflamed Rat Ankle Joints, Agents Actions 25, pp.216-18 (1988). Следовательно, активация 5-НТ2-рецепторов также может играть роль в возникновении периферической боли и нейрогенного воспаления.
Назначением раствора по настоящему изобретению является блокирование боли и объема воспалительных процессов. Таким образом, антагонисты 5-НТ2-и 5-НТ3 -рецепторов оба подходят для использования либо по отдельности, либо вместе в растворе по настоящему изобретению. Амитриптилин (Elavil) подходит в качестве антагониста 5-НТ2-рецепторов для применения по настоящему изобретению. Амитриптилин использовался в клинике в течение многих лет в качестве антидепрессанта, и было установлено, что он оказывает полезное действие у некоторых пациентов с хронической болью. Метохлорпрамид (Reglan) применялся в клинике в качестве препарата против рвоты, но он проявляет умеренную аффинность к 5-НТ3-рецептору и может ингибировать действие 5-НТ на данном рецепторе, возможно, ингибируя боль за счет высвобождения 5-НТ из тромбоцитов. Таким образом, он также пригоден для применения по настоящему изобретению.
Другие подходящие антагонисты 5-НТ2-рецепторов включают имипрамин, тразодон, дезипрамин и кетансерин. Кетансерин использовался в клинике за счет его антигипертензивного действия. Hedner Т. et al., Effects of a New Serotonin Antagonist, Ketanserin, in Experimental and Clinical Hypertension, Am J of Hypertension, pp.317s-23s (Jul. 1988). Другие пригодные антагонисты 5-НТ 3-рецепторов включают цизаприд и ондасетрон. Подходящие антагонисты рецепторов серотонина1В включают иохимбин, N-[метокси-3-(4-метил-1-пиперазинил)фенил]-2'-метил-4'-(5-метил-1,2,4-оксадиазол-3-ил) [1, 1-бифенил]-4-карбоксамид («GR127935») и метиотепин. Терапевтические и предпочтительные концентрации для применения этих лекарственных препаратов в растворе по настоящему изобретению приведены в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1
Терапевтические и предпочтительные концентрации ингибирующих боль и/или противовоспалительных агентов
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Антагонисты рецепторов серотонина2
амитриптилен 0,1-1,000 50-500
дезипрамин 0,1-1,000 50-500
кетансерин 0,1-1,000 50-500
Антагонисты рецепторов серотонина 3:
трописетрон 0,01-100 0,05-50
метоклопрамид 10-10,000 200-2,000
цизаприд 0,1-1,000 20-200
ондасетрон 0,1-1,000 20-200
Антагонисты серотонина 1в (человеческого 1D)
изомолтар 0,1-1,000 50-500
GR127935 0,1-1,000 10-500
метиотепин 0,1-500 1-100
SB216641 0,2-2,000 2-200
2. АГОНИСТЫ СЕРОТОНИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Известно, что 5-HT1A-, 5-HT1B- и 5-НТ1D-рецепторы ингибируют активность аденилатциклазы. Таким образом, низкая доза агонистов данных рецепторов серотонина1A, серотонина 1B и серотонина1D в растворе будет ингибировать нейроны, опосредующие боль и воспаление. Такое же действие ожидается от агонистов рецепторов серотонина1E и серотонина 1F, поскольку данные рецепторы также ингибируют аденилатциклазу.
Буспирон является подходящим агонистом 1A-рецептора для применения по настоящему изобретению. Суматриптан является подходящим агонистом 1А-, 1В-, 1D- и 1F-рецепторов. Подходящим агонистом 1В- и 1D-рецепторов является дигидроэрготамин. Подходящим агонистом 1Е рецепторов является эргоновин. Терапевтические и предпочтительные концентрации данных агонистов рецепторов представлены в таблице 2.
ТАБЛИЦА 2
Терапевтические и предпочтительные концентрации ингибирующих боль и/или противовоспалительных агентов
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Агонисты серотонина1А
буспирон 1-1,000 10-200
сумитрипан 1-1,000 10-200
Агонисты серотонина 1в:
дигидроэрготамин 0,1-1,000 10-100
суматрипан 1-1,000 10-200
наратрипан 1-1,000 10-200
ризатриптан 1-1,000 10-200
золмитриптан 1-1,000 10-200
L-694,247 1-1,000 10-200
Агонисты серотонина1D:
дигидроэрготамин 0,1-1,000 10-100
суматриптан 1-1,000 10-200
наратриптан 1-1,000 10-200
ризатриптан 1-1,000 10-200
золмитриптан 1-1,000 10-200
L-694,247 1-1,000 10-200
Агонисты серотонина1E:
эргоновин 10-2,000 100-1,000
Агонисты серотонина1E: 1-1, 000 10-200
3. АНТАГОНИСТЫ ГИСТАМИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Гистаминовые рецепторы обычно подразделяются на подтипы гистамина1 (H1) и гистамина2 (Н2). Классическая воспалительная ответная реакция на периферическое введение гистамина опосредуется через H1-рецептор: Douglas, 1985. Следовательно, раствор по настоящему изобретению предпочтительно включает антагонист рецептора гистамина H1. Прометазин (Phenergan) представляет обычно применяемый против рвоты препарат, который в значительной степени блокирует H1-рецепторы и подходит для применения по настоящему изобретению. Интересно, что было показано, что данный препарат обладает местным анестезирующим действием, но концентрации, необходимые для проявления данного эффекта на несколько порядков выше, чем те, которые необходимы для блокирования H1-рецепторов, таким образом, полагают, что данные эффекты осуществляются по различным механизмам. Концентрация антагонистов гистаминовых рецепторов в растворе достаточна для ингибирования H1-рецепторов, участвующих в активации ноцицепторов, но не для достижения "местного анестезирующего" действия, тем самым устраняется значение системных побочных эффектов.
Другие подходящие антагонисты H1-рецепторов включают терфенадин, дифенгидрамин, амитриптилин, мепирамин и триполидин. Поскольку амитриптилин также эффективен в качестве антагониста рецептора серотонина2, он обладает двойной функцией при использовании по настоящему изобретению. Подходящие терапевтические и предпочтительные концентрации для каждого из данных агонистов H1-рецепторов приведены в таблице 3.
ТАБЛИЦА 3
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Антагонисты рецепторов гистамина1:
прометазин 0,1-1,000 50-200
дифенгидрамин 0,1-1,000 50-200
амитриптилен 0,1-1,000 50-500
терфенадин 0,1-1,000 50-500
мепирамин (пириламин) 0,1-1,000 5-200
триполидин 0,1-100 5-20
4. АНТАГОНИСТЫ БРАДИКИНИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Брадикининовые рецепторы обычно подразделяются на подтипы брадикинина1 (B1) и брадикинина2 (В2). В исследованиях было показано, что острая периферическая боль и воспаление, продуцируемые брадикинином, опосредуются подтипом B2 в то время, как индуцируемая брадикинином боль при хроническом воспалении опосредуется через подтип B1 : Perkins M.N. et al., Antinociceptive Activity of the Bradykinin B1 and B2 Receptor Antagonists, des-Arg 9, [Leu8]-BK and HOE 140, in Two Models of Persistent Hyperalgesia in the Rat, Pain 53, pp.191-197 (1993); Dray A. et al., Bradykinin and Inflammatory Pain, Trends Neurosci 16, pp.99-104 (1993), каждый из этих источников включен здесь для сведения.
В настоящее время антагонисты брадикининовых рецепторов не используются в клинике. Некоторые из этих препаратов являются пептидами, и их нельзя принимать перорально, поскольку они подвергнутся перевариванию. Антагонисты В2-рецепторов блокируют индуцируемую брадикинином острую боль и воспаление: Dray et al., 1993. Антагонисты B1-рецепторов ингибируют боль при хронических воспалительных состояниях. Perkins et al., 1993; Dray et al., 1993. Следовательно, в зависимости от применения раствор по настоящему изобретению предпочтительно включает один или оба антагониста брадикинина B1 и В2 . Например, артроскопию проводят при острых и хронических состояниях, и, таким образом, орошающий раствор для артроскопии может включать антагонисты как B1-рецепторов, так и В2 -рецепторов.
Подходящие антагонисты брадикининовых рецепторов для применения по настоящему изобретению включают следующие антагонисты брадикининовых1 рецепторов: [дез-Arg10] производное D-Arg-(Hyp3Thi5D-Tic7 Oic8)-BK ("[дез-Arg10] производное НОЕ 140", от Hoechst Pharmaceuticals); и [Leu8 ] дез-Arg9ВК. Подходящие антагонисты брадикининовых 2 рецепторов включают: [D-Phe7-BK; D-Arg-(Hyp 3Thi5,8-Phe7)-BK ("NPC 349"); D-Arg-(Hyp3D-Phe7)-BK ("NPC 567"); и D-Arg-(Нур3Thi5 D-Tic 7-Oic8)-ВК ("НОЕ 140"). Подходящие терапевтические и предпочтительные концентрации приведены в таблице 4.
ТАБЛИЦА 4
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Антагонисты рецепторов брадикинина1:
[Leu8] дез-Arg9ВК 1-1,000 50-500
[дез-Агд10] производное НОЕ140 1-1,000 50-500
[leu9] [дез-Arg 10] каллиден 0,1-500 10-200
Антагонисты рецепторов брадикинина2:
[D-Phe7 ]-BK 100-10,000 200-5,000
NPC 349 1-1,000 50-500
NPC 567 1-1,000 50-500
НОЕ 140 1-1,000 50-500
5. ИНГИБИТОРЫ КАЛЛИКРЕИНА
Пептид брадикинин представляет важный медиатор боли и воспаления, как уже отмечалось ранее. Брадикинин продуцируется в качестве продукта расщепления под действием калликреина на высокомолекулярных кининогенах в плазме. Следовательно, полагается, что ингибиторы калликреина будут оказывать лечебное действие при ингибировании продукции брадикинина и возникающих в результате болей и воспаления. Подходящим ингибитором калликреина для применения по настоящему изобретению является апротинин. Подходящие концентрации для применения в растворах по настоящему изобретению представлены ниже в таблице 5.
ТАБЛИЦА 5
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Ингибитор калликреина1:
Апротинин 1-1,000 50-500
6. АНТАГОНИСТЫ ТАХИКИНИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Тахикинины (TKs) представляют семейство структурно близких пептидов, которые включают вещество Р, нейрокинин А (NKA) и нейрокинин В (NKB). Нейроны являются основным источником TKs в периферических тканях. Важным общим действием TKs является стимуляция нейронов, но другие эффекты включают зависимое от эндотелия расширение сосудов, экстравазацию белков плазмы, восстановление и дегрануляцию тучных клеток и стимуляцию клеток воспаления: Maggi С.A., Gen. Pharmacol., Vol.22, pp.1-24 (1991). За счет вышеуказанной комбинации физиологических эффектов, опосредуемых активацией рецепторов ТК, целенаправленное воздействие на ТК-рецепторы является разумным подходом к способствованию анальгезии и лечению нейрогенного воспаления.
6а. АНТАГОНИСТЫ ПОДТИПА НЕЙРОКИНИНОВЫХ1 РЕЦЕПТОРОВ
Вещество Р активирует подтип нейрокининовых рецепторов, относящихся к NK1. Вещество Р представляет ундекапептид, который находится в сенсорных нервных окончаниях. Известно, что вещество Р обладает многими эффектами, которые приводят к воспалению и боли в периферических тканях после активации С-волокон, включая расширение сосудов, экстравазацию плазмы и дегрануляцию тучных клеток. Levine J.D. et al., Peptides and the Primary Afferent Nociceptor, J. Neurosci. 13, p.2273 (1993). Подходящим антагонистом вещества Р является (CD-Pro9 [спиро-гамма-лактам] Leu10, Trp11] физалаемин-(1-11)) ("GR 82334"). Другими подходящими антагонистами для применения по настоящему изобретению, которые воздействуют на NK1 -рецепторы, являются: 1-имино-2-(2-метоксифенил)этил)-7,7-дифенил-4-пер-гидроизоиндолон(3аR,7аR) ("RP 67580"); и 2S,3S-цис-3-(2-метоксибензиламино)-2-бензгидрилхинуклидан ("СР 96345"'). Подходящие концентрации данных агентов представлены в таблице 6.
ТАБЛИЦА 6
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Антагонисты подтипа рецепторов нейрокинина1 :
GR 82334 1-1,000 10-500
СР 96,345 1-10,000 100-1,000
RP 67580 0,1-1,000 100-1,000
6b. АНТАГОНИСТЫ ПОДТИПА НЕЙРОКИНИНОВЫХ2 РЕЦЕПТОРОВ
Нейрокинин А представляет пептид, который находится в сенсорных нейронах с веществом Р и который также способствует возникновению воспаления и боли. Нейрокинин А активирует специфические нейрокининовые рецепторы, относящиеся к NKa. Edmonds-Alt S. et al., A Potent and Selective Non-Peptide Antagonist of the Neurokinin A (NK:2) Receptor, Life Sci. 50:PL101 (1992). Примеры подходящих антагонистов NK2 включают: ((S)-N-метил-N-[4-(4-ацетиламино-4-фенилпиперидино)-2-(3,4-дихлорфенил) бутил]-бензамид ("(±)-SR 48968"); Met-Asp-Trp-Phe-Dap-Leu ("MEN 10627"); и цик(GIn-Trp-Phe-Gly-Leu-Met) ("L 659877"). Подходящие концентрации данных агентов приведены в таблице 7.
ТАБЛИЦА 7
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Антагонисты подтипа рецепторов нейрокинина2 :
MEN 10,627 1-1,000 10-1,000
L 659,877 10-10,000 100-10,000
(±)-SR 48968 10-10,000 100-10,000
7. Антагонисты CGRP-рецепторов
Пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), является пептидом, который также находится в сенсорных нейронах с веществом Р и который действует в качестве вазодилататора и усиливает действие вещества: Р. Brain S.D. et al., Inflammatory Oedema Induced by Synergism Between Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) and Mediators of Increased Vascular Permeability, Br. J. Pharmacol. 99, p.202 (1985). Примером подходящего антагониста CGRP-рецепторов является I-CGRP-(8-37), усеченный вариант CGRP. Данный полипептид ингибирует активацию CGRP-рецепторов. Подходящие концентрации данного агента приведены в таблице 8.
ТАБЛИЦА 8
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Антагонист CGRP-рецепторов
I-CGRP-(8-37) 1-1,000 10-500
8. АНТАГОНИСТ ИНТЕРЛЕЙКИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Интерлейкины представляют семейство пептидов, называемых цитокинами, продуцируемые лейкоцитами и другими клетками в ответ на медиаторы воспаления. Интерлейкины могут быть сильными гипералгическими агентами в периферических тканях. Ferriera S.H. et al., Interleukin-1 as a Potent Hyperalgesic Agent Antagonized by a Tripeptide Analogue, Nature 334, p.698 (1988). Примером подходящего антагониста IL-1-рецептора является Lys-D-Pro-Thr, который представляет усеченный вариант IL-1. Данный трипептид ингибирует активацию IL-1-рецепторов. Подходящие концентрации данного агента приведены в таблице 9.
ТАБЛИЦА 9
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Антагонист интерлейкиновых рецепторов
Lys-D-Pro-Thr 1-1,000 10-500
9. ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТОВ, ВОВЛЕЧЕННЫХ В СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПУТЬ МЕТАБОЛИЗМА АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ
9а. Ингибиторы фосфолипазы
Продукция арахидоновой кислоты с участием фосфолипаз А 2 (PLA2) (cPLA2, iPLA2 , sPLA2) и фосфолипазы С (PLC) приводит к каскаду реакций, в которых образуются многочисленные медиаторы воспаления, известные как эйкозаноиды. Имеется ряд стадий на данном пути, которые можно ингибировать, тем самым снижая продукцию данных медиаторов воспаления. Примеры ингибирования на данных различных стадиях приведены ниже.
Ингибирование изоформы фермента PLA2 подавляет высвобождение арахидоновой кислоты из клеточных мембран и, следовательно, ингибирует продукцию простагландинов и лейкотриенов, приводя к подавлению воспаления и боли: Glaser К.В., Regulation of Phospholipase A2 Enzymes: Selective Inhibitors and Their Pharmacological Potential, Adv. Pharmacol. 32, p.31 (1995). Примером подходящего ингибитора изоформы PLA2 является маноалид. Подходящие концентрации данного агента включены в таблицу 10. Ингибирование изоформы фосфолипазы С (PLC ) также приведет к пониженной продукции простаноидов и лейкотриенов и, следовательно, будет приводить к пониженной боли и воспалению. Примером ингибитора изоформы PLC является 1-[6-((17-3-метоксиэстра-1,3,5(10)-триен-17-ил)амино)гексил]-1Н-пиррол-2,5-дион.
ТАБЛИЦА 10
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Ингибитор фосфолипазы
маноалид 100-100,000 500-10,000
аристолохоновая кислота 40-400,000 400-40,000
АСА 10-100,000 100-10,000
HELSS 6-6,000 60-6,000
9b. Ингибиторы циклооксигеназы
Нестероидные противовоспалительные препараты (NSAIDs) широко используются в качестве противовоспалительных, антипиретических, антитромбических и аналгезирующих агентов. Lewis R.A., Prostaglandins and Leukotrienes, In: Texbook of Rheumatology, 3d ed. (Kelley W.N. et al., eds.), p.258 (1989). Молекулярными мишенями для данных лекарственных препаратов являются циклооксигеназы типа I и типа II (СОХ-1 и СОХ-2). Данные ферменты известны так же, как простагландин Н-синтаза (PGHS)-l (конститутивная) и -2 (индуцируемая), и они катализируют превращение арахидоновой кислоты в простагландин Н, который является промежуточным продуктом в биосинтезе простагландинов и тромбоксанов. Фермент СОХ-2 обнаружен в эндотелиальных клетках, макрофагах и фибробластах. Данный фермент индуцируется под действием IL-1 и TNF-, и его экспрессия повышается в местах воспаления. Активность конститутивной СОХ-1 и активность индуцированной СОХ-2 приводят к синтезу простагландинов, которые участвуют в развитие боли и воспаления.
Многие коммерческие NSAIDs (диклофенак, напроксен, индометацин, ибупрофен и т.п.) в основном являются неселективными ингибиторами обеих изоформ СОХ, но могут проявлять более высокую селективность в отношении СОХ-1 по сравнению с СОХ-2, хотя данное соотношение варьирует для различных соединений. Применение ингибиторов СОХ-1 и 2 для блокирования образования простагландинов представляет лучшую терапевтическую стратегию, чем попытка блокировать взаимодействия естественных лигандов с семью описанными подтипами простаноидных рецепторов. Антагонисты эйкозаноидных рецепторов (ЕР-1, ЕР-2, ЕР-3), о которых сообщалось, являются довольно редкими и только специфическими, сообщалось об антагонистах с высокой аффинностью рецептора тромбоксана А2: Wallace J. and Cirino G. Trends in Pharm. Sci., Vol. 15, pp. 405-406 (1994).
Типичные терапевтические и предпочтительные концентрации ингибиторов циклооксигеназы для применения в растворе приводятся в таблице 11.
ТАБЛИЦА 11
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Ингибиторы циклооксигеназы:
кеторолак 100-10,000 500-5,000
индометацин 1,000-500,000 10,000-200,000
9с.Ингибиторы липооксигеназы
Ингибирование фермента липооксигеназы подавляет продукцию лейкотриенов, таких как лейкотриен В4, который, как известно, является важным медиатором воспаления и боли. Lewis R.A., Prostaglandins and Leukotrienes, In: Texbook of Rheumatology, 3d ed. (Kelley W.N. et al., eds.), pp.258 (1989). Примером антагониста 5-липооксигеназы является 2,3,5-триметил-6-(12-гидрокси-5,10-додекадиинил)-1,4-бензохинон ("АА 861"), подходящие концентрации которого приведены в таблице 12.
ТАБЛИЦА 12
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Ингибитор липооксигеназы:
АА 861 100-10,000 500-5,000
кофейная кислота 500-50,000 2,000-20,000
10. АНТАГОНИСТЫ ПРОСТАНОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Специфические простаноиды, продуцируемые в качестве метаболитов арахидоновой кислоты, опосредуют их воспалительные эффекты через активацию простаноидных рецепторов. Примерами групп специфических простаноидных антагонистов являются антагонисты подтипов рецепторов эйкозаноида ЕР-1 и ЕР-4 и антагонисты подтипа рецепторов тромбоксана. Подходящим антагонистом рецептора простагландина Е2 является 8-хлорди-бенз[b,f][1,4]оксазепин-10(11Н)-карбоновая кислота, 2-ацетилгидразид ("SC 19220"). Подходящим антагонистом подтипа рецепторов тромбоксана является [15-[1,2(5Z),3,4]-7-[3-[2-(фениламино)-карбонил]гидразино]метил]-7-оксобицикло-[2,2,1]-гепт-2-ил]-5-гептановая кислота ("SO 29548"). Подходящие концентрации данных агентов приведены в таблице 13.
ТАБЛИЦА 13
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Антагонист эйкозаноида ЕР-1:
SC 19220 100-10,000 500-5,000
11. АНТАГОНИСТЫ ЛЕЙКОТРИЕНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Лейкотриены (LTB4, LTC4 и LTD4) представляют продукты метаболизма арахидоновой кислоты при участии 5-липооксигеназы, которые продуцируются ферментативно и обладают важными биологическими свойствами. Лейкотриены участвуют в развитии ряда патологических состояний, включая воспаление. Многие фармацевтические компании в настоящее время ведут поиск специфических антагонистов в целях потенциального терапевтического вмешательства в данные патологии. Halushka P.V. et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29: 213-239 (1989); Ford-Hutchinson A., Crit. Rev. Immunol. 10: 1-12 (1990). LTB4-рецептор обнаружен в некоторых клетках иммунной системы, включая эозинофилы и нейтрофилы. Связывание LTB4 с данными рецепторами приводит к хемотаксису и высвобождению лизосомальных ферментов, тем самым способствуя развитию процесса воспаления. Передача сигналов, связанная с активацией LTB4-рецептора, включает опосредуемую G-белком стимуляцию метаболизма фосфотидилинозита (PI) и увеличение внутриклеточного кальция (см. фигуру 2).
Примером подходящего антагониста рецептора лейкотриена В4 является SC(+)-(S)-7-(3-(2-циклопропилметил)-3-метокси-4-[(метиламино)-карбонил]фенокси(пропокси)-3,4-дигидро-8-пропил-2Н-1-бензопиран-2-пропановая кислота ("SC 53228"). Концентрации данного агента, которые подходят для практики настоящего изобретения, приведены в таблице 14. Другие подходящие антагонисты рецепторов лейкотриена 84 включают [3-[-2(7-[хлор-2-хинолил)этенил]фенил][[3-(диметиламино-3-оксопропил)тио]метил]тиопропановую кислоту ("МК 0571") и препараты LY 66071 и ICI 203219. МК 0571 также действует в качестве антагониста подтипа рецепторов LTD4.
ТАБЛИЦА 14
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Антагонист лейкотриена
В4:
SC 53228 100-10,000 500-5,000
12. АГОНИСТЫ ОПИОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Активация опиоидных рецепторов приводит к антиноцицептивным эффектам, и, следовательно, агонисты для данных рецепторов является желаемыми. Опиоидные рецепторы включают подтипы -, - и -опиоидных рецепторов, -рецепторы располагаются в окончаниях периферических сенсорных нейронов и активация данных рецепторов подавляет активность сенсорных нейронов: Basbaum A.I. et al., Opiate analgesia: How Central is a Peripheral Target?, N. Engi. J. Med., 325:1168 (1991). - и -рецепторы находятся в симпатических эфферентных окончаниях и ингибируют высвобождение простагландинов, тем самым подавляя боль и воспаление. Taiwo Y.O. et al., Kappa- and Delta-Opioids Block Sympathetically Dependent Hyperalgesia, J. Neurosci., Vol.11, page 928 (1991). Подтипы опиоидных рецепторов являются членами надсемейства сопряженных с G-белком рецепторов. Следовательно, все агонисты опиоидных рецепторов взаимодействуют и инициируют передачу сигнала через их родственный сопряженный с G-белком рецептор. Примерами подходящих агонистов -опиоидных рецепторов являются фентанил и Try-D-Ala-Gly-[N-MePhe]-NH(CH 2)-ОН ("DAMGO"). Примером подходящего агониста -опиоидных рецепторов является [D-Pen2,D-Pen5]энкефалин ("DPDPE"). Примером подходящего агониста к-опиоидных рецепторов является (транс)-3,4-дихлор-N-метил-N-[2-(1-пирролидинил)циклогексил]-бензолацетамид ("U 50488"). Подходящие концентрации каждого из данных агентов приведены в таблице 15.
ТАБЛИЦА 15
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Агонист -опиоидов:
DAMGO 0,1-100 0,5-20
суфентанил 0,01-50 1-20
фентанил 0,1-500 10-200
PL 017 0,05-50 0,25-10
Агонист -опиоидов:
DPDPE 0,1-500 1,0-100
Агонист -опиоидов:
U50,488 0,1-500 1,0-100
13. АНТАГОНИСТЫ ПУРИНОЦЕПТОРОВ
Внеклеточная АТФ действует в качестве сигнальной молекулы через взаимодействия с Р2-пуриноцепторами. Одной большой группой пуриноцепторов являются Р2X-пуриноцепторы, которые являются воротными лигандами ионных каналов, обладающими внутренними ионными каналами, проницаемыми для Na+, К+ и Са2+ . Р2X-рецепторы, описанные в сенсорных нейронах, являются важными для первичной афферентной передачи нервного импульса и восприятия боли. Известно, что АТФ деполяризует сенсорные нейроны и играет роль в активации ноцицепторов, поскольку АТФ, высвобождаемая из поврежденных клеток, стимулирует Р2X-рецепторы, приводя к деполяризации ноцицептивных окончаний нервных волокон. Р2Х3-рецепторы имеют очень ограниченное распространение (Chen С.С. et al., Nature, Vol.377, pp.428-431 (1995)), поскольку они селективно экспрессируются в сенсорных нервных С-волокнах, которые проходят в спинной мозг, и известно, что многие данные С-волокна несут рецепторы для болевых стимулов. Таким образом, высоко ограниченная локализация экспрессии субъединиц Р2Х 3-рецепторов делает эти подтипы превосходными мишенями для аналгезирующего действия (см. фигуры 3 и 7).
Кальций-мобилизующие пуриновые рецепторы, которые относятся к надсемейству рецепторов G-белка, описаны на поверхности суставных хондроцитов у млекопитающих. Было установлено, что АТФ стимулирует зависимое от дозы, временное повышение концентрации ионов кальция в дифференцированных первичных хондроцитах. В опытах с гетерологичной десенсибилизацией было показано, что хондроциты не проявляют последующий ответ на УТФ после начала стимуляции под действием АТФ. Эти результаты согласуются с наличием Р2Y-рецепторов на клеточной поверхности хондроцитов. Индуцированная пурином мобилизация кальция в пассажированных хондроцитах показывает аналогичный фармакологический профиль в отношении чувствительности к агонисту. АТФ и УТФ не изменяют синтез матрикса хряща, что было определено по скорости включения [35S]сульфата в гликозаминогликан в хрящевых эксплантатах или первичных хондроцитах. Разрушение матрикса, определенное по высвобождению гликозаминогликана из хрящевых эксплантатов, также не изменялось под действием любого агониста. Присутствие функциональных пуриновых Р2Y-рецепторов на поверхности первичных суставных хондроцитов способствует концентрациям внеклеточных пуринов, таких как АТФ, активировать метаболизм хондроцитов.
В других исследованиях была установлена экспрессия генами Р1- и Р2-пуриновых рецепторов в человеческих суставных хондроцитах и профильное опосредуемое лигандами высвобождение простагландина Е2. Агонисты Р2Y2-рецепторов АТФ и УТФ стимулировали незначительное высвобождение PGE2, которое синергетически усиливалось после предварительной обработки человеческим IL-1. Высвобождение PGE2 в ответ на совместное добавление АТФ и УТФ после предварительной обработки IL-1 мимикрировалось форболмиристатом ацетатом. Функцией P2Y2-рецептора является усиление опосредуемого IL-1 высвобождения PGE2, что тем самым способствует возникновению боли и воспаления в суставе. Таким образом, применение антагонистов P2Y в настоящем изобретении будет предупреждать активацию продукции медиаторов воспаления, как синовиоцитами, так и хондроцитами.
Подходящие антагонисты Р2X/АТФ-пуриноцепторов для применения по настоящему изобретению включают, в виде примера, сурамин и пиридоксифосфат-6-азофенил-2,4-дисульфоновую кислоту ("PPADS"). Подходящие концентрации данных агентов приведены в таблице 16.
ТАБЛИЦА 16
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, ингибирующих боль и/или воспаление
Группа агента Терапевтические концентрации (наномолярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Р2Х и/или P2Y Антагонисты:
сурамин 100-100,000 10,000-100,000
PPADS 100-100,000 10,000-100,000
14. АНТАГОНИСТЫ Са2+-каналов
Антагонисты кальциевых каналов представляют отдельную группу лекарственных препаратов, которые препятствуют трансмембранному потоку ионов кальция для активации клеточных ответов, опосредующих нейровоспаление. Вхождение ионов кальция в синовиоциты и хондроциты является ключевым событием, опосредующим активацию ответов в данных клетках. Кроме того, роль брадикининовых, гистаминовых, серотониновых (SHT 2) и нейрокининовых рецепторов (NK1 и NK 2) в опосредовании пути передачи сигнала при нейровоспалении, включает повышение внутриклеточного кальция, приводя таким образом к активации кальциевых каналов на плазменной мембране. Во многих тканях антагонисты кальциевых каналов, такие как нифедипин, могут снижать высвобождение арахидоновой кислоты, простагландинов и лейкотриенов, которые возникают под действием различных стимулов: Moncada S., Flower R. and Vane J. in Goodman's and Oilman's Phannacological Basis of Therapeutics, (7th ed.), MacMillan Publ. Inc., pp.660-5 (1995).
Наконец, антагонисты кальциевых каналов и каждый из антагонистов тахикинина, гистамина или брадикинина проявляют синергетическое действие в подавлении нейровоспаления. Установлена роль нейрокининовых рецепторов в опосредовании нейровоспаления. Путь передачи сигнала с участием рецепторов нейрокинина1 (NK1) и нейрокинина 2 (NK2) (члены сопряженного с G-белком надсемейства) включает повышение внутриклеточного кальция, приводя таким образом к активации кальциевых каналов на плазменной мембране. Аналогичным образом, активация рецепторов брадикинина2 (ВК2) сопряжена с повышением внутриклеточного кальция в синовиоцитах и хондроцитах. Таким образом, антагонисты кальциевых каналов взаимодействуют с общим механизмом, вызывающим повышение внутриклеточного кальция, часть которого проходит через каналы L-типа. Это является основой для синергетического взаимодействия между антагонистами кальциевых каналов и антагонистами рецепторов нейрокинина, гистамина, P2Y и брадикинина2 .
Подходящие антагонисты кальциевых каналов для практики настоящего изобретения включают нисолдипин, нифедипин, нимодипин, лацидипин, израдипин и амлодипин. Подходящие концентрации данных агентов приведены в таблице 17.
ТАБЛИЦА 17
Терапевтические и предпочтительные концентрации агентов, подавляющих спазмы
Группа агента Терапевтические концентрации (наномэлярные) Предпочтительные концентрации (наномолярные)
Антагонисты кальциевых каналов:
низолдипин 1-10,000 100-1,000
нифедипин 1-10,000 100-5,000
нимодипин 1-10,000 100-5,000
лацидипин 1-10,000 100-5,000
израдипин 1-10,000 100-5,000
амподипин 1-10,000 100-5,000
II. АГЕНТЫ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ РАЗРУШЕНИЯ ХРЯЩА
Недавние достижения в понимании биохимии и молекулярной биологии воспаления и деструкции хряща прояснили роль многочисленных эндогенных цитокинов. Многочисленными провоспалительными медиаторами, которые участвуют в распаде хряща в воспаленном суставе, являются цитокины, TNF-, IL-1, IL-6 и IL-8. Повышенные уровни ряда данных провоспалительных цитокинов быстро появляются в синовиальной жидкости коленных суставов при остром повреждении и остаются повышенными у пациентов по меньшей мере в течение 4 недель (Cameron, ML et al., "Synovial fluid cytokine concentrations as possible prognostic indicators in the ACL-deficient knee". Knee Sung. Sports Traumatol. Arthroscopy 2:38-44 (1994)). Данные цитокины продуцируются местно в суставе несколькими активированными типами клеток, включая синовиальные фибробласты, синовиальные макрофаги и хондроциты. Образованные местно цитокины опосредуют патофизиологические события при острых и хронических воспалительных состояниях и являются важными аутокринными и паракринными медиаторами в катаболизме хряща. Действие данных цитокинов характеризуется их способностью вызывать многочисленные эффекты на различных клеточных мишенях и их способностью взаимодействовать позитивным или отрицательным синергетическим образом с другими цитокинами. Особенно важными являются IL-1 и TNF-, поскольку они также инициируют разрушающие хрящ эффекты нарушением баланса между нормальным обменом и деструкцией компонентов хрящевого матрикса путем модуляции активности эндогенных белков, например матричных металлопротеиназ (MMPs), и тканевым ингибитором металлопротеиназы (TIMP). Регуляция под действием цитокинов гомеостаза в хряще представляет высоко регулируемый баланс между активными медиаторами, действующими в хондроцитах, который определяет, будет иметь место разрушение матрикса или его восстановление.
Повреждение сустава часто приводит к воспалительной ответной реакции внутри суставного пространства, которая вовлекает синовиальную ткань и может привести к разрушению суставного хряща. Описаны наглядные сдвиги метаболизма в синовиальной жидкости и хряще в колене у человека после повреждения сустава и атроскопической операции (Cameron M.L. et al. (1994), выше; Cameron M.L. et al. "The natural history of the anterior cruciate ligament-deficient knee: Changes in synovial fluid cytokine and keratan sulfate concentrations", Am. J. Sports Med. 25:751-754 (1997)). Уровни специфических провоспалительных цитокинов наглядно возрастают (на 2-4 порядка по сравнению с обычным значением) в синовиальной жидкости коленного сустава во время фазы острого воспаления после разрыва передней крестообразной связки колена (ACL). Значительные изменения также происходят в концентрациях молекул хрящевого матрикса за счет повышенной продукции матричных металлопротеиназ (MMPs), таких как коллагеназа и стромелизин-1, которые повышены в синовиальной жидкости пациентов после острой травмы (Lohmander L.S. et al. "Temporal patterns of stromelysin-1 tissue inhibitor, and proteoglycan fragments in human knee joint fluid after injury to the cruciate ligament or meniscus", J. Orthopaedic Res. 12:21-28 (1994)). Временные изменения цитокинов и маркеров хрящевого матрикса (например, протеогликанов) в синовиальной жидкости, которые коррелируют с разрушением хряща, являются максимальными в период острого повреждения, но остаются повышенными в течение продолжительного периода времени (от 3 месяцев до одного года), медленно снижаясь и оставаясь выше по сравнению с фоновыми уровнями до повреждения.
Сама по себе травма в результате артроскопической операции вызывает сильное послеоперационное воспаление, которое отражает дополнительную воспалительную активацию клеток в суставе, включая положительную регуляцию циклооксигеназы-2 и других провоспалительных цитокинов. У значительной части пациентов (60-90%) с разрывом ACL выявлены изменения колена на рентгеновских снимках, указывающие на остеоартрит (ОА) через 10-15 лет после повреждения (Cameron M.L. et al. (1994), выше). Таким образом, объединенные эффекты первоначального повреждения сустава и хирургической травмы могут индуцировать непрерывное воспалительное состояние и связанные изменения в метаболизме хрящевого матрикса, которые являются причинными факторами, приводящими к последующему развитию дегенеративных изменений в суставном хряще и вскоре развитию остеоартрита. Значение данной проблемы здравоохранения является существенным, поскольку общее установленное количество артроскопических вмешательств, проводимых только в США, составляло в 1996 году 1,8 млн с установленной скоростью роста примерно 10% в год. Таким образом, желательно обеспечить фармацевтический способ для предупреждения разрушения суставного хряща внутри сустава.
Несмотря на то, что боль и воспаление в послеоперационном периоде признаются, как значительные клинические проблемы, схемы фармакологического лечения в настоящее время направлены только на острую анальгезию в послеоперационном периоде. Существующие правила хирургического лечения не направлены на хроническое воспалительное состояние, которое возникает после операции, и необходимость подавлять деструкцию хряща в суставе после операции. Следовательно, имеется четкая необходимость в разработке эффективной интегрированной лекарственной терапии, которая будет направлена как на острые, так и на хронические аспекты боли и воспаления, а также патологические изменения в метаболизме хряща в поврежденном или оперированном суставе.
По данному аспекту изобретения обеспечивается способ подавления или профилактики деструкции суставного хряща в суставе введением непосредственно в сустав пациента композиции, которая включает один или более метаболически активных защитных для хряща агентов вместе с одним или более обезболивающими и противовоспалительными агентами, как описано ранее, или альтернативно комбинацию двух или более метаболически активных защитных для хряща агентов, по меньшей мере один из которых способствует протеканию анаболических процессов в хряще и по меньшей мере один из которых является ингибитором катаболических процессов в хряще, в фармацевтически эффективном носителе для внутрисуставной доставки. Метаболически активные агенты включают, но не ограничиваются, всеми соединениями, которые действуют прямо или опосредованно с модуляцией или изменением биологического, биохимического или биофизического состояния клетки, включая агенты, которые изменяют электрический потенциал плазменной мембраны, связывание лигандов или ферментативную активность клеточных рецепторов, внутриклеточных и внеклеточных ферментов, взаимодействия белок-белок, взаимодействия РНК-белок или взаимодействия ДНК-белок. Например, такие агенты могут включать агонисты рецепторов, которые начинают каскады передачи сигналов, антагонисты рецепторов, которые ингибируют пути передачи сигналов, активаторы и ингибиторы внутриклеточных и внеклеточных ферментов и агенты, которые модулируют связывание факторов транскрипции с ДНК.
В частности, один аспект настоящего изобретения обеспечивает фармакологический способ лечения поврежденного или оперированного сустава с использованием комбинации защитных для хряща агентов, доставленных местно для достижения максимального терапевтического эффекта. Применение комбинации защитных для хряща агентов преодолевает ограничения существующих терапевтических подходов, которые основаны на использовании одного агента для блокирования многофакторного процесса деструкции хряща, в котором происходит сдвиг между синтезом и деградацией в пользу катаболических процессов. Данный аспект изобретения исключительно использует подход объединения агентов, которые действуют одновременно на различные молекулярные мишени для способствования анаболизму хряща и ингибированию нерегулируемых или избыточных катаболических процессов в хряще с достижением максимального подавления воспалительных процессов и сохранением гомеостаза в хряще, тем самым достигая защитного для хряща эффекта внутри сустава. Ингибирование одной молекулярной мишени или биохимического механизма, известных как индуцирующие деструкцию (катаболизм) хряща, такое как ингибирование связывания интерлейкина-1 (IL-1) с рецептором IL-1, вероятно, не будет оптимальным, поскольку, например, действие TNF-, опосредуемое через его уникальный рецептор, разделяет многие перекрывающиеся провоспалительные и катаболические функции в хряще с IL-1, и он также признан как один из важных медиаторов деструкции хряща в суставе. Аналогичным образом, использование фармацевтических агентов, которые только усиливают анаболические процессы в хряще в отсутствии подавления катаболических процессов, не будет оптимально противодействовать катаболическим факторам, присутствующим в поврежденном суставе.
В частности, один аспект настоящего изобретения обеспечивает фармацевтические композиции метаболически активных защитных для хряща агентов, которые базируются на комбинации по меньшей мере двух агентов, которые действуют одновременно на различные молекулярные мишени. В типичном воплощении по меньшей мере один агент является агонистом рецепторов цитокинов и факторов роста, который непосредственно обеспечивает противовоспалительную активность и/или способствует анаболическим процессам в хряще, и по меньшей мере второй агент является антагонистом рецепторов или ингибитором ферментов, который действует для подавления провоспалительных и/или катаболических процессов в хряще. Типичная комбинация лекарственных препаратов включает по меньшей мере один агент, выбранный из группы противовоспалительных/анаболических цитокинов, который действует функционально для подавления роли провоспалительных цитокинов в суставе, способствует синтезу хрящевого матрикса и ингибирует разрушение матрикса. Данные агонисты рецепторов включают, но не ограничиваются, специфическими противовоспалительными и анаболическими цитокинами, такими как агонисты интерлейкинов (IL) (например, IL-4, IL-10 и IL-13) и специфическими членами надсемейства трансформирующего фактора роста- (например, TGFB- и ВМР-7), инсулиноподобными факторами роста (например, IGF-1) и факторами роста фибробластов (например, bFGF). По меньшей мере второй агент выбран из группы антагонистов рецепторов и ингибиторов ферментов, который ингибирует и снижает активность или экспрессию провоспалительной молекулярной мишени (например, антагонисты IL-1-рецепторов, антагонисты TNF--рецепторов, ингибиторы циклооксигеназы-2, ингибиторы МАРкиназы, ингибиторы синтазы окиси азота (NOS) и ингибиторы ядерного фактора kappaB (NFB). Метаболически активные агенты включают функциональные агонисты и антагонисты рецепторов, расположенных на поверхностях клеток, а также ингибиторы связывания с мембранами или внеклеточно секретируемых ферментов (например, стромелизина и коллагеназы). Кроме того, многие агенты направлены на новые мишени, которые являются внутриклеточными ферментами и факторами транскрипции, которые передают и интегрируют сигналы поверхностных рецепторов, включая ингибиторы ферментов NOS, COX-2 и митоген-активированных протеинкиназ (МАРК) и ингибиторы взаимодействий белок-ДНК, такие как фактор транскрипции NFB. Данный способ позволяет сохранять целостность хряща, одновременно способствуя протеканию опосредуемых цитокинами анаболических процессов и ингибируя катаболические процессы.
Комбинацию из многих препаратов можно доставлять местно внутрисуставной инъекцией или инфузией, включая периоперативное введение (т.е. перед операцией и/или во время операции и/или после операции) во время хирургических артроскопических процедур, одно или в сочетании с постоперационной постоянной доставкой, такой как регулируемая система доставки с помощью насоса или другая система доставки с постоянным высвобождением. Системы доставки с постоянным высвобождением могут включать, но не ограничиваются, микрочастицами, микросферами или наночастицами, состоящими из белков, липосом, углеводородов, синтетических органических соединений или неорганических соединений. Таким образом, в некоторых воплощениях изобретение обеспечивает комбинацию агентов для доставки инъекцией или инфузией, одни или вместе с обезболивающими или противовоспалительными агентами. Быстрое начало действия, достигаемое прямой, местной доставкой защитных для хряща агентов во время или близко ко времени повреждения (например, периоперативно) имеет потенциал ингибировать начальные процессы перед тем, как они "запускают" последующие ответные реакции, и тем самым ограничивает местное повреждение тканей и последующее разрушение хряща.
Преимущества данного аспекта настоящего изобретения включают: 1) терапию комбинацией препаратов, направленную на многофакторные причины деструкции хряща во время острых и хронических состояний; 2) комбинацию защитных для хряща агентов можно сочетать с противовоспалительными и обезболивающими агентами; 3) местная доставка комбинации препаратов достигается мгновенным созданием терапевтической концентрации защитных для хряща агентов внутри сустава; 4) использование орошающего раствора периоперативно обеспечивает постоянное сохранение уровней лекарственных препаратов внутри сустава в терапевтически желаемом пределе во время артроскопической хирургической процедуры; 5) местная доставка позволяет снизить общую дозу лекарственного препарата и частоту дозирования по сравнению с системной доставкой; 6) местная, направленная на место операции доставка в сустав позволяет избежать системной токсичности и уменьшить побочные эффекты; и 7) прямая местная доставка в сустав позволяет применять новые фармацевтически активные пептиды и белки, включая цитокины и факторы роста, которые могут не быть терапевтически полезными, если ограничены системными путями введения.
1. АНТАГОНИСТЫ РЕЦЕПТОРОВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 (IL-1)
Интерлейкин IL-1 находится в двух формах, IL-1 и IL-1, которые представляют полипептиды, производные отдельных генных продуктов, которые разделяют одинаковый спектр иммунорегуляторных и провоспалительных функций. IL-1 является полипептидом массой 17 kD, который воздействует на и может продуцироваться рядом клеточных типов в суставе, включая синовиальные фибробласты и макрофаги, хондроциты, эндотелиальные клетки и моноциты, и макрофаги. Имеется существенное доказательство того, что IL-1 играет центральную роль в воспалении сустава и патофизиологической потере суставного хряща, которые имеют место в поврежденном суставе.
Действие обеих форм данного разрушающего хрящ цитокина опосредуется двумя IL-1-рецепторами (IL-1R), рецепторами типа I IL-1 или типа II IL-1. IL-1-рецепторы структурно различаются и относятся к отдельным надсемействам, характеризующимся наличием доменов связывания иммуноглобулинов. Данные рецепторы имеют тесную аминокислотную гомологию с другими рецепторами, включающими иммуноглобулиновые домены. Экспрессия IL-1-рецептора более крупного типа I имеется в Т-клетках и фибробластах, в то время как IL-1-рецептор меньшего типа II имеется в В-клетках, моноцитах, нейтрофилах и клетках костного мозга.
IL-1-рецепторы типа II связывают IL-1 с высокой аффинностью, но связывание IL-1 не инициирует внутриклеточную передачу сигнала, как это происходит при связывании с IL-1-рецепторами типа I. В противоположность рецептор типа II служит в качестве предшественника растворимого фактора связывания IL-1, который, как было показано, распространяется из клеток, и данный растворимый рецептор служит в качестве физиологического антагониста IL-1. Описан естественный белок связывания IL-1, который соответствует растворимой внешней части рецептора типа II.
Естественный секретируемый растворимый лиганд, который связывается с IL-1-рецепторами, альтернативно относящийся к антагонисту IL-1-рецепторов (sIL-1RA, IL-1Ra, IL-1ra), был клонирован, секвенирован, и было установлено, что он кодирует белок массой 22 kD. IL-1Ra конкурентно ингибирует связывание IL-1 и IL-1 с IL-1-рецепторами обоих типов I и II. IL-1Ra представляет чистый антагонист рецепторов, поскольку его связывание с рецептором не активирует механизм клеточной передачи сигнала, связанных с мембраной IL-1-рецепторов. Несмотря на высокую аффинность связывания этого белка с IL-1Rs, необходим 10-100-кратный молярный избыток для ингибирования биологических ответов клеток на IL-1, которые экспрессируют тип I IL-1R. Известные клетки, которые продуцируют IL-1Ra, включают моноциты, нейтрофилы, макрофаги, синовиоциты и хондроциты. Было показано, что IL-1Ra ингибирует синтез PGE2, индукцию провоспалительных цитокинов и MMPs и продукцию окиси азота. Секретированный IL-1Ra высвобождается in vivo во время экспериментально индуцированного воспаления. Важно, что IL-1Ra экспрессируется в синовиальной ткани и находится в обычной синовиальной жидкости человека. У пациентов с повреждениями колена уровни IL-1Ra в синовиальной жидкости наглядно возрастают в острой фазе после повреждения и затем снижаются до нормальных уровней в подострой и хронической фазах. Таким образом, было показано, что IL-1Ra играет физиологическую роль в ответных реакциях сустава на травму.
IL-1 считается основным разрушающим хрящ цитокином, который играет центральную роль в деструкции сустава за счет его способности стимулировать продукцию ферментов деградации и провоспалительных цитокинов как хондроцитами, так и синовиоцитами. Кроме того, IL-1 является сильным ингибитором синтеза протеогликана и коллагена в хондроцитах. На клеточном уровне, индуцируемые IL-1 ответные реакции синовиальных фибробластов включают повышенную продукцию PGE2, коллагеназы и других нейтральных протеаз и положительную регуляцию уровня провоспалительных цитокинов, IL-6 и IL-8.
IL-1, который находится в суставной жидкости пациентов с артритными заболеваниями, стимулирует хондроциты к: 1) синтезу повышенных количеств ферментов, таких как стромелизин, коллагеназа фибробластов и нейтрофилов и активатор плазминогена и 2) ингибированию синтеза ингибитора-1 активатора плазминогена и ТМР. Кроме того, IL-1 представляет сильный ингибитор синтеза матричных компонентов, таких как коллаген типа II, преобладающая форма коллагена в суставном хряще и протеогликанов. Нарушение баланса между уровнями ингибиторов и протеаз приводит к увеличению количества активных протеаз. Данное повышение в сочетании с подавлением биосинтеза матрикса приводит к разрушению хряща. В опытах на животных инъекция IL-1 в коленные суставы кроликов вызывает истощение протеогликана из суставного хряща.
Поскольку IL-1 является одним из ключевых цитокинов, участвующих в патогенезе хронического синовита и разрушения хряща, снижение его продукции или блокирование его действия представляет соответствующую стратегию для новых видов лечения в целях подавления синовиального воспаления и обеспечения защитного для хряща эффекта. Можно использовать различные терапевтические подходы для препятствования взаимодействию агониста, IL-1, с его естественным связанным с мембраной рецептором, которые включают: 1) естественные специфические ингибиторы активности IL-1, которые были охарактеризованы к настоящему времени, включая IL-1Ra и растворимые IL-1-рецепторы; 2) анти-ILAbs и 3) небольшие молекулы-антагонисты, которые могут быть пептидами или непептидами.
Способность блокировать действие данного ключевого цитокина будет оказывать влияние на многие клеточные типы в суставе (например, синовиальные фибробласты и хондроциты), ингибируя таким образом патологические эффекты, такие как инфильтрация воспалительных клеток в сустав, синовиальная гиперплазия, активация синовиальных клеток, а также распад хряща и подавление синтеза хрящевого матрикса. Антагонист IL-1-рецепторов будет блокировать распространение воспалительного ответа на IL-1 и таким образом прерывать болезненный процесс. Установлен на моделях воспаления и артрита (RA и ОА) у животных терапевтический потенциал ряда антагонистов IL-1-рецепторов. Состояние пациентов, страдающих RA, улучшалось клинически после подкожной инъекции IL-1Ra или внутрисуставного введения растворимого IL-1R типа I.
Эффекты IL-1 и IL-1Ra зависят от их соответствующих местных концентраций. В супернатантах кусочков синовиума уровни IL-1 были в три раза выше, чем таковые для IL-1Ra. Таким образом, спонтанная местная продукция IL-1Ra не является достаточной для ингибирования эффектов IL-1, поскольку необходим больший (10-100-кратный) молярный избыток IL-1Ra для ингибирования IL-1-индуцируемых биологических ответных реакций в клетках, которые экспрессируют IL-1R типа I. Таким образом, высокие дозы IL-1Ra использовались in vivo для блокирования IL-1 у добровольцев-пациентов с RA. IL-1Ra, находящийся местно в синовиуме, обеспечивает отрицательный сигнал, подавляющий по меньшей мере часть опосредуемых IL-1 процессов при синовите, таких как скопление лейкоцитов в воспаленной ткани, продукция PGE2 и продукция коллагеназы синовиальными клетками. Был показан защитный для хряща эффект IL-1Ra с использованием прямой инъекции IL-1Ra в сустав на модели ACL у собаки и с использованием подхода генной терапии, основанной на трансфекции гена IL-1Ra в человеческие синовиальные фибробласты.
Настоящее изобретение раскрывает местную доставку растворимого рецепторного белка IL-1, который состоит из внеклеточного домена IL-1 и который способен связываться с молекулой цитокина IL-1 в растворе. В частности, и в виде примера, здесь раскрывается растворимый человеческий IL-1-рецепторный полипептид (shuIL-1R), включающий в основном аминокислотную последовательность 1-312, как раскрывается в патенте США №5319071 и патенте США №5726148, для применения в комбинации с одним или более лекарственными препаратами, выбранными из противовоспалительной группы, обезболивающей группы или защитной для хряща группы. Альтернативно предлагается местная доставка слитого белка, состоящего из полипептида, включающего домен связывания sIL-1R, для применения в целях защиты хряща, как раскрыто в патенте США №5319071. Кроме того, местная доставка антагониста IL-1-рецептора, раскрытого в патенте США №5817306, раскрывается для применения по настоящему изобретению. Было показано, что растворимый рецептор shuIL-1R связывается с IL-1 с наномолярной аффинностью. Местная доставка терапевтически эффективной концентрации растворимого IL-1R-рецептора, такого как shuIL-1R, может происходить прямой инъекцией в сустав или в орошающем растворе (например, во время артроскопической хирургической процедуры) в комбинации с одним или более защитным для хряща лекарственным препаратом, противовоспалительными препаратами или обезболивающими препаратами, и раскрывается здесь в качестве защитного для хряща агента, при местном применении на ткани сустава при различных воспалительных или патофизиологических состояниях. Подобная обработка будет упреждающе ингибировать стимуляцию под действием IL-1 продукции коллагеназы-1 и стромелизина-1. Используя полностью иной способ, основанный на генной доставке в целях местной продукции растворимых рецепторов типа I для IL-1 и/или TNF-, было установлено, что присутствие растворимых рецепторов для данных цитокинов способно предоставлять защиту коленного сустава у кроликов во время острой фазы воспаления индуцированного антигеном артрита.
Антагонисты-пептиды IL-1-рецепторов (11-15 аминокислот), которые специфически связываются с высокой аффинностью с человеческим IL-1-рецептором типа I подходят для применения по настоящему изобретению в качестве защитных для хряща агентов. Данные небольшие пептиды обеспечивают ряд преимуществ по сравнению с более крупными рекомбинантными растворимыми IL-1-рецепторами или рекомбинантными IL-1ra, которые включают простоту и стоимость синтеза и способность проникать через биологические барьеры. Двумя наиболее сильными пептидами, основываясь на данных по эффективности in vitro, являются: Ас-FEWTPGWYQJYALPL-NH2 (AF12198, IC50=0,5-2 нМ) и Ac-FEWTPGWYQJY-NH2 (AF11567). AF11567 представляет усеченный вариант AF12198 с потерей 4 С-концевых остатков и проявляющий несколько более низкую аффинность в отношении IL-1-рецепторов типа I, но обладающий сходным периодом полувыведения из плазмы крови 2,3-2,6 ч. Оказалось, что слабая растворимость и быстрый метаболизм ограничивают эффективность AF12198 в условиях in vivo при системном введении путем внутривенной инфузии. Данные ограничения частично преодолеваются с помощью способов прямой местной доставки, такой как инъекция во внутрисуставное пространство или включения в хирургическую орошающую жидкость или другой инфузией, как описано в данном изобретении. Примеры антагонистов-агентов IL-1-рецепторов, подходящих для настоящего изобретения, приведены ниже. Для всех способов местной доставки (т.е. инъекции, инфузии или орошения) оптимальной дозой и/или концентрацией каждого подходящего агента является таковая, которая терапевтически эффективна. В качестве примера для каждого из перечисленных агентов приводятся предпочтительные и наиболее предпочтительные концентрации орошающего раствора, содержащего входящий в перечень агент, предполагается, что данные концентрации являются терапевтически эффективными.
ТАБЛИЦА 18
Терапевтические и предпочтительные концентрации антагонистов рецепторов интерлейкина-1
Соединение Терапевтические концентрации (нМ) Наиболее предпочтительные концентрации (нМ)
rshuIL-lR 0,2-2000 200
rhIL-Ira 0,2-2000 200
анти-IL-l-антитела 0,2-2000 200
AF12198 0,2-2000 200
AF11567 0,2-2000 200
2. АНТАГОНИСТЫ РЕЦЕПТОРОВ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ (TNF)
TNF-, цитокин в основном продуцируемый активированными макрофагами, обладает многими биологическими эффектами, включая регуляцию транскрипции нескольких генов, которые опосредуются специфическими TNF-рецепторами, а также иммунорегуляторной активностью. Первоначально были клонированы и охарактеризованы два различных рецептора, обозначенные TNF-R1 и TNF-R2, и также было установлено, что они продуцируются в качестве растворимых рецепторов.
Рецепторы в данном семействе являются единственными трансмембранными белками со значительной гомологией в их внеклеточных доменах в то время, как их относительно короткие внутриклеточные домены имеют очень незначительную гомологию последовательностей. Действие TNF является результатом связывания фактора с рецепторами клеточной поверхности, которые находятся практически на всех типах клеток, которые были изучены. Были идентифицированы и клонированы два рецептора. Один тип рецептора, обозначенный как TNFR-II (или тип А, или 75 kDa), кодирует трансмембранный белок из 439 аминокислот и имеет кажущуюся молекулярную массу 75 kDa. Второй тип рецепторов, обозначенный TNFR-I (или тип В, или 55 kDa), имеет кажущуюся молекулярную массу 55 kDa и кодирует трансмембранный белок из 426 аминокислот. TNFR1 включает внутриклеточный домен, который может инициировать передачу сигнала по пути с участием NF-kB.
Оба TNF-рецептора показывают высокую аффинность для связывания TNF-. Были выделены растворимые TNF-рецепторы (sTNFR), и было доказано, что они образуются в результате выделения внеклеточных доменов, связанных с мембраной рецепторов. Было идентифицировано два типа sTNFR и они были обозначены, как sTNFRl (TNF BRI) и sTNFRII (TNF BPII). Было показано, что обе эти формы растворимых рецепторов представляют усеченные формы двух типов TNFR, описанных выше.
TNF- играет центральную роль в последовательности клеточных и молекулярных событий, лежащих в основе воспалительной ответной реакции и деструкции хряща. Многие эффекты TNF- перекрываются с провоспалительными эффектами IL-1. Среди провоспалительных эффектов TNF- находится его стимуляция высвобождения других провоспалительных цитокинов, включая IL-1, IL-6 и IL-8. TNF- также индуцирует высвобождение матричных металлопротеиназ из нейтрофилов, фибробластов и хондроцитов, которые приводят к разрушению хряща, отчасти в результате стимуляции коллагеназы. Кроме того, TNF- повышает активность СОХ-2 в обычных человеческих суставных хондроцитах и синовиальных фибробластах, приводя к повышенной продукции PGE2.
Считается, что данный цитокин, наряду с IL-1, инициирует и продуцирует патологические воздействия на хрящ в суставе, включая инфильтрацию лейкоцитами, синовиальную гиперплазию, активацию синовиальных клеток, распад хряща и ингибирование синтеза хрящевого матрикса. В частности, во время синовиального воспаления установлены повышенные уровни TNF- в синовиальной жидкости суставов, и имеет место повышенная продукция TNF- синовиальными клетками. Таким образом, местная доставка растворимого TNF--рецептора в орошающей жидкости, инфузии или инъекции будет приводить к связыванию свободного TNF- и функционировать в качестве антагониста TNF-рецепторов в окружающей ткани, обеспечивая таким образом защитное действие в отношении хряща.
Настоящее изобретение описывает применение функциональных антагонистов TNF-, которые действуют внеклеточно для блокирования взаимодействия лиганда с их родственными мембранными рецепторами либо утилизацией доступного свободного лиганда, либо прямым конкурентным взаимодействием с самим рецептором, одного или в комбинации с другими агентами с обеспечением защитного для хряща эффекта. Можно использовать различные терапевтические подходы, которые противодействуют взаимодействию агониста, TNF-, с его естественным связанным с мембраной рецептором, которые включают: 1) применение естественных специфических ингибиторов активности TNF-, которые охарактеризованы к настоящему времени, включая растворимые TNF--рецепторы; 2) применение анти-TNF- антител и 3) применение небольших молекул-антагонистов, которые могут быть пептидами или непептидами.
Настоящее изобретение раскрывает применение химерного растворимого рецепторного (CSR) белка, в котором внеклеточный домен TNF-рецептора, который обладает активностью связывать молекулу TNF, ковалентно связан с доменом молекулы IgG. В частности, и в виде первого примера, можно использовать химерный полипептид (рекомбинантная химера), включающий внеклеточный домен TNF-рецепторного внеклеточного пептида, сопряженного с СН2- и СН3-областями тяжелой цепи мышиного IgGI, как раскрыто в патенте США №5447851. Было показано, что химерный растворимый TNF-рецептор (также обозначенный "химерным ингибитором TNF" в патенте США №5447851) связывается с TNF- с высокой аффинностью, и было показано, что он высоко активен в качестве ингибитора биологической активности TNF-. Кроме того, вторым примером является химерная слитая конструкция, включающая связывающий лиганд домен TNF-рецептора с участками Fc-антител (обозначенных слитыми растворимыми Fc-рецепторами), которые были получены для TNF--рецепторов. Настоящее изобретение также раскрывает применение растворимого TNF-рецептора: слитого Fc-белка или любых модифицированных форм, как раскрыто в патенте США №5605690. Молекулярная форма активного растворимого рецепторного слитого белка может быть либо мономерной, либо димерной. Имеются исследования, в которых было установлено, что такой растворимый TNF-рецептор: слитый Fc-белок сохраняет высокую связывающую активность для TNF-.
В контексте определения растворимых рецепторов в качестве фармакологических антагонистов термин растворимые рецепторы включает, но не ограничивается: 1) растворимыми рецепторами, которые соответствуют естественно (эндогенным) образованным аминокислотным последовательностям или их растворимым фрагментам, состоящим из внеклеточного домена полной длины мембранного рецептора; 2) рекомбинантными растворимыми рецепторами, которые являются усеченными, или неполными последовательностями от полной длины естественных аминокислотных последовательностей рецепторов, которые сохраняют способность связываться с родственным лигандом и сохраняют биологическую активность и их аналоги; и 3) химерными растворимыми рецепторами, которые являются рекомбинантными растворимыми рецепторами, включающими усеченные или неполные последовательности, соответствующие участку внеклеточного связывающего домена, от полной длины аминокислотных последовательностей рецепторов, связанные через олигомеры (например, аминокислоты), с последовательностью, соответствующей участку IgG-полипептида (например, петля IgG и Fc-домен), которые сохраняют биологическую активность и способность связываться с родственным лигандом.
Растворимые внеклеточные связывающие лиганд домены цитокиновые рецепторов имеются в жидкостях организма, и полагают, что они участвуют в регуляции биологической активности цитокинов. Сообщалось о наличии естественных растворимых усеченных форм ряда гематопоэтических цитокиновых рецепторов (IL-1R, IL-4R, IL-6R, TNFR). Например, растворимый TNFR обнаружен в концентрациях примерно 1-2 нг/мл в сыворотке и моче здоровых субъектов. Теряя функции передачи сигнала, данные цитокиновые связывающие белки возникают в результате альтернативного сплайсинга мРНК для полной рецепторной последовательности (связанная с мембраной форма) или в результате протеолитического расщепления и высвобождения связанной с мембраной формы рецептора. Несмотря на то, что функции данных растворимых усеченных рецепторов in vivo полностью еще не установлены, оказалось, что они действуют в качестве физиологических антагонистов их комплементарных эндогенных цитокинов. Данный антагонизм имеет место в результате того, что 1) утилизация свободного лиганда посредством связывания с его родственным растворимым рецептором уменьшает эффективную свободную концентрацию, доступную для связанных с мембраной рецепторов и 2) действие цитокинов происходит только после последующего связывания с рецепторами клеточной поверхности.
Растворимый TNF--рецептор будет функционировать в качестве естественного антагониста TNF-R1 и TNF-R2, конкурируя с данными рецепторами клеточной поверхности за общий пул свободных лигандов. Фармакологически растворимый TNF-рецептор будет функционировать в качестве антагониста в большей степени за счет его способности уменьшать биодоступность свободных лигандов, чем механизма конкурентного ингибирования (т.е. конкурируя с эндогенными лигандами за общее место связывания на мембранном рецепторе). Введение терапевтически эффективного количества растворимого TNF-рецептора в сустав будет эффективно нейтрализовать биологическую активность лиганда. Опыты, в которых рекомбинантные растворимые рецепторы вводили in vivo, показали их способность ингибировать воспалительные ответные реакции и действовать в качестве антагонистов.
В данном изобретении агенты, подходящие в качестве защитных для хряща агентов для применения в комбинации с другими защитными для хряща, обезболивающими и/или противовоспалительными агентами для подавления разрушения хряща, включают растворимый TNFR, человеческий химерный полипептид (рекомбинантная химера), включающий внеклеточный домен TNF--рецептора (р80), связанный с Fc-участком человеческого IgGI, и анти-TNF- антитела. Для всех способов местной доставки (т.е. инъекции, инфузии и орошения) оптимальной дозой и/или концентрацией каждого подходящего агента является таковая, которая терапевтически эффективна. В качестве примера для каждого из перечисленных агентов приводятся предпочтительные и наиболее предпочтительные концентрации орошающего раствора, содержащего входящий в перечень агент, предполагается, что данные концентрации являются терапевтически эффективными.
ТАБЛИЦА 19
Терапевтические и предпочтительные концентрации антагонистов TNF-рецепторов
Соединение Терапевтические концентрации (нМ) Наиболее предпочтительные концентрации (нМ)
sTNFR 0,1-2000 200
химерный rhTNFR:Fc 0,1-2000 200
анти-TNF- антитела 0,2-2000 200
3. АГОНИСТЫ ИНТЕРЛЕЙКИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Некоторые цитокины являются сигнальными гликопротеидами, которые представляют важные медиаторы синовиального воспаления и деструкции хряща. На основании недавно проведенного анализа механизма деструкции хряща можно предположить, что в определении деструкции хряща важен не только абсолютный уровень провоспалительного основного цитокина, IL-1, но и то, что регуляция цитокином гомеостаза в хряще определяется балансом катаболических и анаболических регуляторных цитокинов и факторов анаболического роста. Если баланс между продукцией IL-1 и IL-1R изменяется при воспалении в пользу IL-1, тогда он способствует патогенезу хронических воспалительных состояний и деструкции хряща, что, как известно, происходит после хирургической операции на коленном суставе. Потенциальные терапевтические агенты, которые будут ингибировать продукцию провоспалительных цитокинов в местах воспаления внутри сустава, включают противовоспалительные цитокины, IL-4, IL-10 и IL-13. Наблюдали, что данные цитокины значительно снижают деструкцию суставного хряща in vitro и in vivo посредством их действия на ряд путей, которые снижают уровень дающего толчок IL-1. Таким образом, противовоспалительные цитокины, такие как IL-4, IL-10 и IL-13, могут быть подходящими для подавления воспаления посредством: 1) уменьшения продукции провоспалительных цитокинов и 2) индукции продукции естественных противовоспалительных цитокинов, таких как IL-IRa, как было недавно показано in vivo для IL-4.
Оказалось, что IL-4 ослабляет воспалительный процесс в синовиуме у пациентов с ревматоидным артритом (RA). Было показано, что IL-4 в синовиуме при ревматоидном артрите ингибирует продукцию провоспалительных цитокинов кусочками синовиума, с ингибированием пролиферации синовиоцитов и снижением резорбции кости. IL-4 может оказывать прямой защитный для хряща эффект через подавление синтеза матричной металлопротеиназы-3 (ММР-3) в человеческих суставных хондроцитах. Была использована клеточная культура человеческих суставных хондроцитов для оценки действия IL-4 на индуцированную IL-1 продукцию ММР-3 и тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 (TIMP-1). Было установлено, что IL-4 подавляет IL-1-стимулированный ММР-3 белок и его ферментативную активность. Кроме того, IL-4 подавляет индуцированную IL-1 мРНК ММР-3. Индукция iNOS может ингибироваться IL-4, IL-10 и IL-13. Таким образом, IL-4 может быть охарактеризован как защитный медиатор в процессе деструкции сустава, обнаруживаемой при воспалительных заболеваниях суставов.
Кроме того, установлено, что эффекты IL-4 на баланс уровней регуляторных IL-1-цитокинов способствуют его защитной роли в отношениях хряща. Установлено, что IL-4 и IL-10 подавляли продукцию воспалительных цитокинов свежеприготовленными ревматоидными синовиальными клетками. Несмотря на то, что каждый интерлейкин эффективен по отдельности, комбинация IL-4 и IL-10 синергетически ингибировала стимулированную IL-1 и TNF-, продукцию IL-6 и IL-8, не оказывая при этом действия на жизнеспособность клеток. Добавление IL-4 к культурам синовиума при RA повышает продукцию IL-1Ra и снижает таковую для IL-1. Недавно появилось сообщение о том, что обработка IL-4 in vivo способствует подавлению экспериментального артрита у крыс, дифференцированно действуя на баланс IL-1/IL-1Ra. IL-13, другой цитокин, который разделяет многие свойства IL-4, также индуцирует IL-1Ra в синовиуме при RA. Следовательно, местная доставка комбинации IL-4 и IL-13 может обеспечивать синергетический терапевтический эффект.
IL-10 обладает рядом свойств, которые указывают на то, что он является хорошим потенциальным кандидатом для подавления деструкции хряща. Он ингибирует высвобождение как IL-1, так и TNF-, и стимулирует продукцию TIMP-1, в то же время ингибируя ММР-2. Недавно было сообщено о продукции IL-10 внутри синовиума при RA, и были оценены противовоспалительные эффекты IL-10. IL-10 подавляет продукцию IL-1 на модели RA ex vivo с использованием кусочков синовиума, но в меньшей степени, чем IL-4.
Установлено защитное действие обработки IL-4 и IL-10 в отношении деструкции хряща на моделях артрита у животных с использованием неместных способов доставки цитокинов. На модели индуцированного коллагеном артрита у мышей обработка комбинацией IL-4 и IL-10 приводила к значительному улучшению. Помимо подавления макроскопических признаков воспаления, комбинированная обработка IL-4 и IL-10 также уменьшала клеточные инфильтраты в синовиальной ткани и вызывала выраженную защиту от деструкции хряща. Кроме того, уровни мРНК для TNF-, и IL-1 были в значительной мере снижены как в синовиальной ткани, так и в суставном хряще. В противоположность уровни мРНК антагониста IL-1-рецепторов (IL-IRa) оставались повышенными, на основании чего предполагается, что механизм защиты может быть связан с ингибированной продукцией TNF- и IL-1, наряду с сопутствующим повышением баланса IL-1Ra/IL-1. Данные результаты согласуются с доминирующей ролью IL-10 в эндогенном подавлении воспалительной ответной реакции и деструкции суставного хряща, и оказывается, что комбинированная обработка IL-4 и IL-10 имеет потенциальную терапевтическую ценность.
Также исследовалась роль эндогенных IL-4 и IL-10 и терапевтическое действие добавления данных цитокинов на воспаление сустава и деструкцию хряща на ранних стадиях модели макрофагального стрептококкового артрита у мышей. Было показано, что эндогенный IL-10 играет роль в регуляции артрита SCW. Добавление эндогенного IL-10 дополнительно усиливало супрессивное действие эндогенного IL-10. Даже более выраженный эффект обнаруживали с комбинацией IL-4 и IL-10. Комбинация приводила к уменьшенному отеку и усилению синтеза протеогликана в хондроцитах. Обработка комбинацией IL-4 и IL-10 заметно снижала уровни TNF-, как это имеет место при обработке одним IL-10, но также приводила к заметно пониженным уровням IL-1 в синовиуме, что представляет дополнительный эффект потенциальной пользы для клиники. В целом, данные согласуются с ролью как IL-4, так и IL-10 в качестве защитных для хряща агентов, доставленных местно в суставы для предотвращения деструкции хряща, и указывает, что комбинация, содержащая IL-4 и IL-10, может обеспечить больший потенциальный терапевтический эффект, чем любой агент один.
Мышей с тяжелым сочетанным иммунодефицитом использовали в качестве модели для оценки эффекта инъекции IL-4 или IL-10 на деградацию хряща или восстановление мононуклеарных клеток в синовиуме человека при ревматоидном артрите in vivo. В человеческий ревматоидный синовиум и хрящ от пяти пациентов с ревматоидным артритом вводили рекомбинантный человеческий IL-4 (rhIL-4, 100 нг; rhIL-10, 100 нг), комбинацию IL-4 и IL-10 или TNF-альфа (1000 Е), или забуференный фосфатом физиологический раствор дважды в неделю в течение 4 недель. Было установлено, что комбинация человеческих IL-4 и IL-10 ингибировала разрешение хряща и инвазию человеческой синовиальной тканью, что свидетельствует о защитных для хряща свойствах данных агонистов интерлейкинов.
Человеческий IL-13 был клонирован и секвенирован, и было установлено, что он разделяет многие свойства IL-4. IL-13 примерно на 25% гомологичен IL-4. Подобно IL-4 IL-13 снижает продукцию провоспалительных цитокинов, включая IL-1 и TNF-, мононуклеарными клетками синовиальной жидкости. IL-13 проявляет противовоспалительное действие in vivo и, таким образом, обладает терапевтическим потенциалом при лечении деструкции хряща в суставе.
Подходящие в качестве агонистов IL-4, IL-10 и IL-13 соединения включают естеств