СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИАНДРОГЕННОЙ И АНТИЭСТРОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ
(51) 6 A61K35/30
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 29.08.2007 - прекратил действие
--------------------------------------------------------------------------------
(14) Дата публикации: 1997.03.10
(21) Регистрационный номер заявки: 93029222/14
(22) Дата подачи заявки: 1993.06.08
(45) Опубликовано: 1997.03.10
(71) Имя заявителя: Бахтинов Анатолий Петрович
(72) Имя изобретателя: Бахтинов Анатолий Петрович
(73) Имя патентообладателя: Бахтинов Анатолий Петрович
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИАНДРОГЕННОЙ И АНТИЭСТРОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Изобретение относится к медицине и касается способа получения биологически активных веществ из сырья животного происхождения, обладающих антиандрогенной и антиэкстрогенной активностью. Способ осуществляется путем гомогенизации спинного мозга, экстрагирования биологически активного вещества раствором хлорида натрия, центрифугирования водной взвеси мозга, осаждения вещества сульфатом аммония, растворения осадка в растворе хлорида натрия, обессоливания, хроматографирования и леофилизации вещества. Способ экологически безвреден, нетрудоемок, экономичен, сокращает время экстрагирования и позволяет получить биологически активное вещества высокой степени чистоты.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к медицине и касается способа получения биологически активных веществ из сырья животного происхождения, обладающих антиандрогенной и антиэстрогенной активностью.
Известен способ получения вещества, обладающего кардиотоническим и гипертензивным действием, включающий гомогенизацию предварительно замороженного мозга в дистиллированной воде, экстрагирование вещества хлороформом, центрифугирование, высушивание, повторную гомогенизацию с дистиллированной водой и последующим осаждением сульфатом аммония (а.с. СССР N 689015 МКИ А 61 К 35/12// C 07 C 7/00, 1979).
Недостатком данного способа является трудоемкость и сложность процесса, применение хлороформа, образующего токсичные продукты при окислении. При получении значительной партии вещества в лабораторных условиях и особенно при промышленной его добыче в окружающую среду будет поступать большой объем газообразного хлороформа, опасного для животных и человека. Кроме того, газовая смесь хлороформ воздух взрывоопасна, что может повлечь пожары и взрывы. Указанные пункты ранее предложенного способа свидетельствуют о значительных его недостатках. Кроме того, вещество, получаемое данным способом, не соответствует высокой степени чистоты, что достигается, например, при разделении веществ методом хроматографии.
Задача изобретения: упростить способ выделения биологически активного вещества, избавиться от применения экологически вредного реагента хлороформа и получить вещество высокой степени чистоты.
Достигается это путем гомогенизации спинного мозга, экстрагирования биологически активного вещества раствором хлорида натрия, центрифугирования водной взвеси мозга, осаждения вещества сульфатом аммония, растворения осадка в растворе хлорида натрия, обессоливания, хроматографирования и леофильной сушки вещества.
Способ осуществляется следующим образом: гомогенизируют спинной мозг и экстрагируют вещество при 10-18oC в течение, например, 30 мин в 0,8-1% растворе хлорида натрия в соотношении 1:10-1:15 с добавлением ЭДТа до 0,05% центрифугируют взвесь мозга в течение 25-30 мин при 6000-9000 об./мин при 5-15oC, дважды осаждают сульфатом аммония. При первом 9% насыщении осаждают высокомолекулярные белки, отбрасывают их и повторным насыщением экстракта сульфатом аммония до 39% осаждают биологически активное вещество, растворяют осадок в 0,85% растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют с получением чистого вещества, леофилизируют его. Выход активного вещества составляет 500 мкг на 1 кг сырья. Полученное таким способом вещество обладает выраженный антиандрогенной (табл. 1) и антиэстрогенной (табл.2) активностью. Оно имеет молекулярную массу 10 300, что подтверждено методом тонкослойной хроматографии с маркерами. Вещество разрушается протезами, инактивируется при кипячении или содержании его в термостате при 37oC в течение 1 часа. Оно осаждается депротеинизирующими средствами: хлоридом натрия, сернокислым аммонием, тетрауксусной кислотой.
Предлагаемые в способе параметры температуры среды, концентрации экстрагента, его соотношения с гомогенатом мозга, скорость центрифугирования являются оптимально допустимыми. Так, экстрагирование ниже 10oC ведет к возрастанию времени экстракции вещества более 1,5 часа, а выше 18oC происходит частичная иноктивация вещества.
Концентрация раствора хлорида натрия менее 0,8% снижает степень экстракции вещества, его выход и увеличивает время этого процесса, а выше 1% способствует осаждению части вещества, снижает его выход.
Соотношение экстрагента с гомогенатом мозга менее 1:10 уменьшает степень экстракции вещества и его выход, а увеличение больше, чем 1:15 не дает положительного эффекта. Центрифугирование взвеси мозга при скорости ниже 6000 об./мин ухудшает осаждение взвешенных частиц мозга и увеличивает время этого процесса до 1 часа, а скорость более 9000 об./мин не повышает эффективность отделения взвешенных частиц мозга.
Центрифугирование при 5-15oC необходимо для сохранения активности термолабильного вещества. Снижение температуры менее 5oC удлиняет время осаждения взвешенных частиц до 1 часа, а выше 15oC приводит к снижению активности вещества.
Пример 1. Берут 100 г свежего или замороженного спинного мозга убойного скота, гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают 10 частями 0,8% раствора хлорида натрия с добавлением 0,05% ЭДТА. Экстракцию проводят при 10oC в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Центрифугируют взвесь ткани мозга в течение 25 мин на рефрижераторной центрифуге при 15oC со скоростью 9000 об. /мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония при 18oC. Первым 9% насыщением сульфатом аммония осаждают высокомолекулярные белки, которые отделяют фильтрованием и отбрасывают. Вторым 39% насыщением осаждают биологически активное вещество. Осадок формируют 1-1,5 часа при 18oC и получают фильтрованием через мелкопористый фильтр. Полученный осадок растворяют в 0,85% растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют и леофилизуют чистое вещество. Выход активного вещества составляет 50 мкг, т.е. 500 мкг на 1 кг сырья.
Пример 2. Берут 100 г свежего или замороженного спинного мозга животного, гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают 15 частями 0,9% раствора хлорида натрия с добавлением 0,0% ЭДТА. Экстракцию проводят при 10oC в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Центрифугируют взвесь ткани мозга в течение 30 мин на рефрижераторной центрифуге при 5oC со скоростью 6000 об. /мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония при 10oC. Первым 9% насыщением осаждают высокомолекулярные белки, которые отделяют фильтрованием и отбрасывают. Вторым 39% насыщением сульфатом аммония осаждают биологически активное вещество. Осадок формируют 1,5 часа при 10oC и получают фильтрованием на мелкопористом фильтре. Полученный осадок растворяют в 0,85% растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют и леофилизуют чистое вещество. Выход активного вещества составляет 50 мкг, т.е. 500 мкг на 1 кг сырья.
Пример 3. Берут 100 г свежего или замороженного спинного мозга животного, гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают 15 частями 1% раствора хлорида натрия с добавлением 0,05% ЭДТА. Экстракцию проводят при 15oC в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Центрифугируют взвесь ткани мозга в течение 25 мин на рефрижераторной центрифуге при 10oC со скоростью 8000 об./мин. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония при 15oC. Первым 9% насыщением сульфатом аммония осаждают высокомолекулярные белки, которые отбрасывают после фильтрования. Вторым 39% насыщением осаждают биологически активное вещество. Осадок формируют в течение 1 часа при 15oC и получают фильтрованием через мелкопористый фильтр. Полученный осадок растворяют в 0,85% растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют и леофилизуют чистое вещество. Выход активного вещества составляет 50 мкг, т.е. 500 мкг на 1 кг сырья.
Таким образом, предлагаемый способ исключает применение токсичного и взрывоопасного реагента хлороформа, вредно влияющего на окружающую среду, нетрудоемок, экономичен, сокращает время экстрагирования и позволяет получить биологически активное вещество высокой степени чистоты.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения биологически активного вещества, обладающего антиандрогенной и антиэстрогенной активностью, заключающийся в том, что спинной мозг животного гомогенизируют, гомогенат смешивают с 0,8 1%-ным раствором хлорида натрия при соотношении 1 10 15, экстрагируют в течение 25-30 мин при 10 18oС, центрифугируют при 5 15oС, надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония, обессоливают, хроматографируют и целевой продукт лиофилизируют.
Независимый научно технический портал
На главную страницу раздела
