СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАГНОИММУНОСОРБЕНТОВ
(51) 6 A61K39/385, C12N11/00, G01N33/53
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие
--------------------------------------------------------------------------------
(14) Дата публикации: 1996.11.10
(21) Регистрационный номер заявки: 5040754/13
(22) Дата подачи заявки: 1992.04.29
(45) Опубликовано: 1996.11.10
(56) Аналоги изобретения: 1. Пушкарь В.Г., Трофимов Е.М. Иммунофлуоресцентный анализ антигенного материала, фиксированного на магнитных полиакриламидных сорбентах /в сб. "Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций" (Тезисы докладов Всесоюзной научнопрактической конференции, Ставрополь, 1986) с.50-53. 2. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов "Методические рекомендации", Волгоград, 1984, с.4-11.
(71) Имя заявителя: Ефременко Виталий Иванович; Тюменцева Ирина Степановна; Хорошенький Александр Георгиевич; Бинатова Виктория Васильевна; Климова Ираида Мефодиевна; Пушкарь Владимир Георгиевич
(72) Имя изобретателя: Ефременко Виталий Иванович; Тюменцева Ирина Степановна; Хорошенький Александр Георгиевич; Бинатова Виктория Васильевна; Климова Ираида Мефодиевна; Пушкарь Владимир Георгиевич
(73) Имя патентообладателя: Ефременко Виталий Иванович; Тюменцева Ирина Степановна; Хорошенький Александр Георгиевич; Бинатова Виктория Васильевна; Климова Ираида Мефодиевна; Пушкарь Владимир Георгиевич
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАГНОИММУНОСОРБЕНТОВ
Использование: иммунодиагностика, медицина, способы получения композиций для селективного концентрирования микроорганизмов. Сущность изобретения: способ заключается в том, что проводят обработку магнитного порошка, готовят водную фазу с последующей эмульсионной полимеризацией водной фазы в органический поток газообразного азота. Промывают гранулы магносорбентов, активируют гранулы глутаральдегидом и включают лиганд. Причем предварительную обработку магнитного порошка осуществляют путем промывки его ацетоном, дистиллированной водой с последующим фосфатированием. Приготовление водной фазы осуществляют в три этапа - это мокрое рассеивание в ацетоне, обработка их детергентом и промывка дистиллированной водой. В результате получают гранулы с магнитными свойствами, которые обеспечивают лучшие гидрофильность и стабильность при использовании для включения антигенного материала в иммунологических исследованиях. 1 табл.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам получения композиций для селективного концентрирования микроорганизмов.
Известен способ эмульсионной полимеризации магносорбентов с одновременным включением лиганда в полимеризующий гель.
Сущность заключается в том, что в водную фазу вместо дистиллированной воды в качестве лиганда вводят иммуноглобулины концентрацией 40 мг/мл по белку. Таким образом, происходит механическое включение биологически активных веществ в ячеистую структуру полиакриламидного геля [1]
Недостатком известного способа полимеризации магносорбентов с одновременным включением лиганда в полимеризующий гель является большой расход высокоспецифичных иммуноглобулинов, что приводит к значительным дополнительным трудозатратам и повышению себестоимости препарата. Усложнен процесс приготовления водной фазы вследствие невозможности температурного воздействия на него при растворении сомономеров реакции полимеризации по причине термолабильности включаемого лиганда.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения магноиммуносорбентов, включающий обработку магнитного материала агарозой; приготовление водной фазы, содержащей сомономеры реакции полимеризации, магнитный порошок и катализатор; приготовление органической фазы, содержащей эмульгатор; эмульсионную полимеризацию водной фазы в органической фазе потоком газообразного азота в присутствии катализатора и детергента; мокрое рассеивание гранул; их активацию глутаральдегидом; включение лиганда [2]
Недостатком этого способа является низкая включаемость магнитного материала в гранулы сорбента, отсутствие стабильности получения микрогранул, недостаточная степень активации поверхности гранул магносорбента и, как следствие, слабая включаемость биологически активных веществ в гранулы сорбента.
Целью предлагаемого изобретения является повышение гидрофильных свойств магнитного порошка для лучшего включения в полиакриламидные гранулы.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что проводят предварительную обработку магнитного порошка. Готовят водную фазу с последующей эмульсионной полимеризацией водной фазы в органической потоком газообразного азота. Промывают гранулы магносорбентов и активируют их глутаральдегидом. Затем включают лиганд. Отличия заключаются в том, что предварительную обработку магнитного порошка осуществляют путем промывки его ацетоном, дистиллированной водой с последующим фосфатированием; приготовление водной фазы осуществляют с добавлением желатины, а промывку гранул магносорбентов проводят в три этапа это мокрое рассеивание в ацетоне, обработка детергентом и промывка дистиллированной водой.
Предлагаемый способ получения магноиммуносорбентов позволяет получить качественно новый магнитный порошок, т. к. фосфатное покрытие кроме дополнительной коррозионной стойкости обеспечивает требуемый уровень гидрофильности, достаточный для включения магнитного порошка в полиакриламидный гель. Кроме того, отпадает необходимость в измельчении плотного агарового блока магнитного порошка, для осуществления которого требовались дополнительные технические приспособления. Предназначенные для этих целей известные отечественные и зарубежные коммерческие препараты (например, французский препарат "Magnogels", волгоградские магноиммуносорбенты) этим качеством не обладают.
Проанализировав отечественные и зарубежные достижения в этом направлении, мы пришли к выводу, что по сравнению с аналогичными решениями, известными из существующего уровня технологии, магнитный порошок, полученный нашим способом, обладает необходимым уровнем гидрофильности, хорошо совместимым с материалом-носителем, имеет повышенную антикоррозионную устойчивость в растворах, гранулы сорбента механически достаточно прочны и имеют выраженные магнитные свойства.
Таким образом, появление новых качественных характеристик непосредственно у препарата, а также принципиально новые операции в процессе его получения позволили нам сделать вывод о соответствии предлагаемого изобретения критерию изобретательского уровня.
Способ осуществляется следующим образом.
1. Обработка магнитного порошка
Навеску магнитного порошка заливают 2- 3-кратным объемом ацетона и перемешивают 3 5 мин. Операцию повторяют 2 3 раза, используя постоянный магнит. Затем магнитный порошок отмывают от ацетона 5 10 объемами дистиллированной воды 3 5 раз. Навеску очищенного порошка помещают в емкость с 5 10 объемами состава, содержащего 2 г/л ортофосфорной кислоты и 2 г/л хлорного железа, доводят до температуры 90 95oC и выдерживают в течение 25 30 мин. Затем магнитный порошок 5 10 раз отмывают 5 10 объемами дистиллированной воды и 3 5 раз 10 объемами 0,1 М ФСБ рН 8,00,1 до получения нейтрального значения рН. Магнитный порошок сушат на фильтровальной бумаге при комнатной температуре.
2. Приготовление водной фазы
Для приготовления водной фазы 1,5 г акриламида и 0,5 г N'N'-метиленбисакриламида растворяют в 5 мл дистиллированной воды при нагревании на водяной бане и перемешивании. К раствору добавляют 0,75 мл 10% раствора желатина. Смесь охлаждают до 10 12oC, вносят в нее 1,5 г магнитного порошка и 6 мг персульфата аммония, производят перемешивание в течение 1 2 мин.
3. Приготовление органической фазы
В реактор объемом 400 500 мл вносят 200 мл гептана и 1 мл СПЭН-85 и производят перемешивание потоком газообразного азота под давлением 0,2 2,0 атм в течение 5 10 мин.
4. Эмульсионная полимеризация водной фазы в органической
Водную фазу вносят в органическую и проводят эмульгирование при 20 - 22oC в течение 10 15 мин при перемешивании азотом. На второй-третьей минуте эмульгирования в реакционную смесь вносят 0,2 мл N',N',N',N' - тетраметилендиамина. После окончания полимеризации смесь сливают и отделяют гранулы с помощью постоянного магнита.
5. Промывка гранул магносорбентов
Гранулы заливают 100 150 мл 50% ацетона и просеивают через сито для отделения частиц размером 20 150 мкм. Затем гранулы 2 раза промывают в 50 - 80 мл 0,05% раствора Твин-20 в дистиллированной воде и 3 раза в 100 150 мл дистиллированной воды без Твин-20.
6. Активация поверхности гранул магносорбентов
Для активации 1 мл магносорбентов вносят флакон с 10 15 мл 5% раствора глутальдегида и в течение 18 ч при температуре 202oC проводят инкубацию при перемешивании.
7. Включение лиганда
Проактивированные гранулы промывают 10 20 мл дистиллированной воды 8 - 10 раз, затем 10 20 мл 0,1 М ФСБ рН 7,60,1 2 3 раза. 1 мл гранул помещают в флакон, содержащий 10 15 мл 0,1 М ФСБ, в котором растворен лиганд (специфичные иммуноглобулины в концентрации 500 мкг/мл). Инкубацию производят в течение 18 ч при комнатной температуре при перемешивании.
Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп магно-иммуносорбенты дополнительно обрабатывают 10 15 мл 0,5 1% раствором альбумина в 0,1 М ФСБ в течение 1 3 ч при перемешивании. Готовый препарат хранят в 0,1 М ФСБ, рН 7,20,1 с добавлением мертиолата натрия в концентрации 1 10000.
Пример выполнения.
2. Обработка магнитного порошка.
Брали 15 г магнитного порошка, заливали 30 мл ацетона и перемешивали в течение 15 минут. Сливали ацетон, используя постоянный магнит. Операцию повторяли 3 раза. Затем магнитный порошок отмывали от ацетона 150 мл дистиллированной воды 5 раз. Промытую таким образом навеску магнитного порошка заливали 150 мл состава, содержащего 2 г/л ортофосфорной кислоты и 2 г/л хлорного железа, нагревали до температуры 95oC и выдерживали в течение 30 минут. Затем магнитный порошок 5 раз отмывали 150 мл дистиллированной воды и 5 раз 150 мл 0,1 М ФСБ, рН 8,00,1 до получения нейтрального значения рН. Магнитный порошок сушили на фильтровальной бумаге при комнатной температуре.
2. Приготовление водной фазы.
Брали 1,5 г акриламида и 0,5 г N',N'-метиленбисакриламида и растворяли их в 5 мл дистиллированной воды при нагревании на водяной бане и перемешивали. К раствору добавляли 0,75 мл 10% раствора желатина. Смесь охлаждали до 10oC, вносили в нее 1,5 г магнитного порошка и 6 мг персульфата аммония, производили перемешивание в течение 1 мин.
3. Приготовление органической фазы.
В реактор объемом 500 мл вносили 200 мл гептана и 1 мл СПЭН-85 и производили перемешивание потоком газообразного азота под давлением 0,2 атм в течение 10 минут.
4. Эмульсионная полимеризация водной фазы в органической.
Водную фазу вносили в органическую и производили эмульгирование при 20oC в течение 15 минут при перемешивании азотом под давлением 1,5 атм. На второй минуте эмульгирования в реакционную смесь вносили 0,2 мл N',N',N',N'-тетраметилендиамина. После окончания полимеризации смесь смывали и отделяли гранулы с помощью постоянного магнита.
5. Промывка гранул магносорбента.
Гранулы заливали 100 мл 50% ацетона и просеивали через сито для отделения частиц размером 20 150 мкм. Затем гранулы 2 раза промывали в 50 мл 0,05% раствора Твин-20 в дистиллированной воде и 3 раза в 150 мл дистиллированной воды без Твин-20.
6. Активация поверхности гранул магносорбентов.
Для активации 1 мл магносорбентов вносили во флакон 10 мл 5% раствора глутаральдегида и в течение 18 ч производили инкубацию при температуре 20oC при перемешивании.
7. Включение лиганда.
Гранулы промывали 10 мл дистиллированной воды 10 раз, затем 10 мл 0,1 М ФСБ рН 7,60,1 3 раза. 1 мл гранул помещали во флакон, содержащий 10 мл того же ФСБ, в котором растворен лиганд (специфичные иммуноглобулины в концентрации 500 мкг/мл), и инкубировали в течение 18 ч при температуре 20oC при перемешивании. Затем гранулы обрабатывали 10 мл 0,5% раствора альбумина в 0,1 М ФСБ рН 7,60,1 в течение 2 ч при перемешивании и температуре 20oC. Готовый препарат хранили в 0,1 М ФСБ рН 7,20,1 с добавлением мертиолата натрия в концентрации 1 10000.
Полученные таким образом магноиммуносорбенты отличаются высокой степенью включаемости материала в гранулы вследствие повышения его гидрофильных свойств, стабильностью получения качественных магногранул, достаточной степенью активации поверхности гранул, обеспечивающей хорошую включаемость биологически активных веществ в гранулы сорбента, малый расход лигандов (см. таблицу).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения магноиммуносорбентов, включающий гидрофилизирующую обработку магнитного порошка, приготовление водной фазы сомономеров полимеризации геля и смеси магнитного порошка с персульфатом аммония, приготовление органической фазы, содержащей эмульгатор, эмульсионную полимеризацию водной фазы в органическую потоком газообразного азота под давлением 0,2-2,0 атм в присутствии катализатора и детергента в течение 15-20 мин, извлечение гранул из эмульсии в магнитном поле, промывку гранул, активацию гранул глутаральдегидом в течение 18-20 ч, иммобилизацию лиганда в гранулы в растворе ФСБ при соотношении сорбента и лиганда 1:10-12 в течение 18-20 ч с последующей обработкой аминосодержащим соединением в течение 2-3 ч, отличающийся тем, что гидрофилизирующую обработку магнитного порошка осуществляют путем промывки его ацетоном в соотношении 1:2-2,5 и дистиллированной водой с последующей обработкой водным раствором ортофосфорной кислоты и хлорного железа с концентрацией каждого 2-2,5 г/л при соотношении Т:Ж 1:10-15 при температуре 95-98oC в течение 30-40 мин и отмывкой дистиллированной водой и ФСБ до нейтральной среды, при приготовлении водной фазы добавляют 10-12%-ный раствор желатины при соотношении 1: 0,15-0,2 с последующим охлаждением до 9-10oС, промывку гранул сорбента проводят 50-52%-ным раствором ацетона через сито с последующей отмывкой гранул в растворе ТВИН-80 и дистиллированной воде, при обработке иммобилизованного сорбента в качестве аминосодержащего соединения используют альбумин, а активацию глутаральдегидом и обработку альбумином проводят при комнатной температуре.
Независимый научно технический портал
На главную страницу раздела
