СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ C3 - КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
(51) 6 G01N33/531
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 18.07.2007 - действует
--------------------------------------------------------------------------------
(14) Дата публикации: 1995.01.09
(21) Регистрационный номер заявки: 5045791/14
(22) Дата подачи заявки: 1992.04.14
(45) Опубликовано: 1995.01.09
(56) Аналоги изобретения: Mol Jmmunology, 16, 767-776, 1978. Biochemistry, 15, n. 20, p. p.4513-4521, 1976.
(71) Имя заявителя: Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского
(72) Имя изобретателя: Матвеевская Н.С.; Алешкин В.А.
(73) Имя патентообладателя: Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского
(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ C3 - КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии и иммунохимии, и может быть использовано в диагностике заболеваний, связанных с активацией системы комплемента. Сущность изобретения заключается в том, что спиртовой осадок IУ - I по Кону осаждают 16%-ным поли- (этиленгликолем) м.м. 4000 - 6000. Из образовавшегося осадка выделяют C3 компонент комплемента, применяя ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-Тоуореа 1 и гельфильтрацию на сефакриле S-200. Предлагаемый способ очистки C3 компонента комплемента человека из осадка IУ - I по Кону имеет преимущества перед прототипом, так как способ не требует дорогостоящих реактивов, исходного сырья, прост в осуществлении. Преимущества изобретения - упрощение и удешевление способа выделения C3 компонента комплемента, утилизация отходов промышленного фракционирования плазмы.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии и иммунохимии, и может быть использовано в диагностике заболеваний, связанных с активацией системы комплемента: болезней иммунных комплексов, инфекционных заболеваний, респираторного дистресс-синдрома взрослых, наследственных дефицитов регуляторных белков системы комплемента.
Известно несколько способов выделения очищенного С3 компонента комплемента человека. Например, широко используется способ выделения С3 компонента комплемента из плазмы, предложенный R. A. Harrison и R. J. Lachmann в 1979 г. , включающий предварительную обработку свежей плазмы ингибиторами (ЭДТА, азидом натрия, фенилметилсульфонилфторидом) с целью предотвращения активации протеолитических ферментов плазмы крови и запуска каскада реакций при активации системы комплемента с последующим фракционированием плазмы гидросульфатом натрия до 20% и переосаждением образовавшегося осадка 11% сульфатом натрия. Супернатант от второго осаждения разделяют на псевдоглобулиновую и эуглобулиновую фракции при диализе в низкой ионной силе и слабокислом рН. С3 компонент комплемента выделяют из осадка эуглобулинов путем ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и хроматографии на гидроксил-апатите. Заканчивают выделение С3 компонента комплемента диализом С3-содержащих фракций против раствора ингибиторов (ЭДТА, NaN3), ультрафильтрацией.
Прототипом получения высокоочищенного С3 компонента комплемента является способ, описанный Tach. B. F. и Prahly. W. (1976 г.). Он включает: ступенчатое фракционирование свежей плазмы с поли-(этиленгликолем) м. м. 4000-6000, ряд последовательных хроматографических процедур (биоспецифическая хроматография на L-лизин-сефарозе 4В для удаления плазминогена, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-фильтрация на сефарозе СL-6В, хроматография на гидроксилапатите) с контролем гемолитической активности на каждой стадии. Способ многостадиен, трудоемок, в нем исползуются дорогостоящие реактивы, сорбенты для хроматографий.
Целью настоящего изобретения является упрощение и удешевление способа выделения С3 компонента комплемента человека, что особенно важно для диагностических препаратов, а также утилизация отходов промышленного фракционирования плазмы.
Цель достигается тем, что С3 компонент комплемента выделяют всего в 3 основные стадии, используя в качестве источника С3 компонента бросовый осадок IV-I по Кону. По данным Cohnetal. (1946 г.) в осадке IV-I, получаемом при фракционировании плазмы крови на холоду, содержатся компоненты комплемента.
Первой стадией выделения С3 из осадка IY-I является осаждение 20% осадка IV-I, растворенного в 0,1 М К-Р, рН 7,1-7,3, 10 мМ ЭДТА, 0,5 М NaCl поли-(этиленгликолем) 4000-6000. 32% ПЭГ 4000-6000 добавляют в 20%-ный раствор осадка IV-I до конечной концентрации 16% ПЭГ 4000-6000 при перемешивании. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 6000 об/мин, 4оС. Осадок служит источником для выделения С3 компонента комплемента. На второй стадии осадок растворяют в 0,01 М К-Р, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА и хроматографируют на колонке с ДЕАЕ-Тоyopear I, уравновешенной тем же буфером, для элюции связавшегося белка, используя линейный градиент концентрации NaCl 0-0,3 М. Идентификацию фракций, содержащих С3, проводят иммунохимически. Далее сконцентрированный с помощью ультрафильтрации на мембране РМ-30 компонент С3 дополнительно очищают гель-фильтрацией на сефакриле S-200 в 0,01 М К-Р, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА, 0,15 М NaCl, 0,02% NaN3.
Предлагаемый способ очистки С3 компонента комплемента из бросового осадка IV-I по Кону имеет преимущества перед прототипом, так как способ не требует дорогостоящих реактивов, прост в осуществлении, имеет всего 3 основных стадии: I - осаждение ПЭГ 4000-6000;
2 - ДЭАЭ-хроматография;
3 - гель-фильтрация.
Очищенный С3 компонент комплемента может быть использован: 1) как иммуноген для гипериммунозации животных с целью получения моноспецифической анти-С3 преципитирующей сыворотки; 2) для удаления нежелательных анти-С3 антител из поливалентных сывороток; 3) для определения титров анти-С3 преципитирующих сывороток методом РИД по Манчини.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ C3 -КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА, включающий обработку сырья на основе крови человека с помощью ПЭГ 4000-6000, центрифугирование с последующими очисткой осадка на ДЭАЭ-анионообменнике и гель-фильтрацией, отличающийся тем, что в качестве сырья используют осадок IV - I фракционирования плазмы крови по Кону, перед обработкой ПЭГ его растворяют в буферном растворе высокой ионной силы при нейтральном рН, а гель-фильтрацию проводят с помощью сефекрила S - 200.
Независимый научно технический портал
На главную страницу раздела
