СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА (ВАРИАНТЫ)
(51) 6 G01N33/543, A61K39/385, G01N33/531, G01N33/551, G01N33/569, C12N11/14
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 29.08.2007 - прекратил действие
--------------------------------------------------------------------------------
(14) Дата публикации: 1999.09.27
(21) Регистрационный номер заявки: 97119147/13
(22) Дата подачи заявки: 1997.11.20
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1997.11.20
(45) Опубликовано: 1999.09.27
(56) Аналоги изобретения: SU 1517545 A, 15.12.93. SU 883053 A, 25.11.81. SU 1443578 A, 01.11.85. SU 2068703 С, 10.11.96.
(71) Имя заявителя: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
(72) Имя изобретателя: Жарникова И.В.; Тюменцева И.С.; Ефременко В.И.; Афанасьев Е.Н.; Бинатова В.В.
(73) Имя патентообладателя: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
(98) Адрес для переписки: 355000, Ставрополь, ул.Советская, 13-15, СНИПЧИ
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА (ВАРИАНТЫ)
Изобретение предназначено для производства иммуносорбентов для выявления специфической реакции антиген-антитело. Изобретение включает модифицирование носителя 0,3-0,4%-ным раствором полиглюкина. Сорбент высушивают и активируют вторичным алкилсульфатом натрия. Активированный сорбент ковалентно связывают с лигандом белковой природы. По первому варианту в качестве носителя используют алюмосиликат, по второму - смесь магнитного порошка и алюмосиликата. Из лигандов белковой природы могут быть использованы, например, иммуноглобулины против возбудителей чумы, холеры или туляремии. Изобретение повышает специфическую емкость и чувствительность иммуносорбента. 2 с.п. ф-лы.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к иммунохимии, микробиологии и может быть использовано в производстве иммуносорбентов для выявления специфической реакции антиген-антитело.
Известен способ получения иммуносорбента на основе целлюлозы, включающий ковалентное связывание белкового лиганда с носителем. Недостатком способа является низкий уровень специфичности сорбента, кроме того, органический носитель непрочен, подвержен разрушению при воздействии микроорганизмов (К.Л. Шаханина и соавт. Приготовление различных иммуносорбентов и их использование для выделения антигенов и антител. Ж. Вопросы мед.химии, N 6, 1976. - С. 127-136).
Перспективными для применения в методах иммуноанализа являются твердофазные носители, в том числе различные гранулированные сорбенты, а в последнее время сорбенты с магнитными свойствами.
Основными требованиями к таким сорбентам являются их инертность по отношению к биологическим препаратам, стабильность свойств, механическая прочность, достаточная сорбционная емкость при иммобилизации лигандов. Наиболее прочное присоединение лигандов к поверхности соpбентов обеспечивается ковалентной связью, которая осуществляется предварительной активацией поверхности сорбентов, например глутаровым альдегидом (В.И.Ефременко, В.Г.Пушкарь и др. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов. ЖМЭИ, N 12, 1989, c. 100-104).
Известен способ получения иммуносорбента, включающий активацию аминопропилсилохрома глутаровым альдегидом в концентрации 12,0-13,0% в течение 2 ч при комнатной температуре и pH 8.0 с последующим ковалентным связыванием белка A из Staphylococcus aureus и промывкой (a.с. СССР N 1517545, G 01 N 33/53, 15.12.93, Бюл. N 45-46).
Используемый в качестве носителя аминопропилсилохром (производства Олайненского завода химреактивов) является дефицитным, активирующий агент недостаточно прочно закрепляется на поверхности носителя, так как глутаровый альдегид гидролизуется в водной среде, что приводит к неспецифической сорбции и снижению стабильности в биоспецифических процессах.
Кроме того, полученный по этому способу иммуносорбент имеет недостаточную специфическую емкость и чувствительность в иммуноанализе. Способ не предусматривает получение иммуносорбента с магнитными свойствами.
Известны способы получения иммуносорбентов с магнитными свойствами.
Способ эмульсионной полимеризации, по которому в реакционную смесь сомономеров полиакриламида и катализатора включают магнитный порошок и лиганд (иммуноглобулины). При этом происходит механическое включение биологически активных веществ в ячеистую структуру полиакриламидного геля (Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций. Тезисы докладов Всесоюзной научно-практической конференции, Ставрополь, 1986, c. 50-53).
Недостатком способа является большой расход иммуноглобулинов концентрацией 40 мг/мл по белку, что повышает себестоимость препарата и ограничивает возможность организации промышленного производства.
По другому способу сначала получают магносорбент путем предварительной обработки магнитного порошка с приданием ему коррозийной стойкости и гидрофильности, затем проводят эмульсионную полимеризацию смеси сомономеров полиакриламида и катализатора с обработанным магнитным порошком. Подготовленный магносорбент активируют 5%-ным глутаровым альдегидом в течение 18-20 ч и иммобилизуют специфичными иммуноглобулинами в растворе ФСБ при инкубации в течение 18-20 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп магноиммуносорбенты дополнительно обрабатывают раствором альбумина в течение 1-3 ч (пат. РФ N 2068703, A 61 K 39/385, C 12 N 11/00 // G 01 N 33/53, оп. 10.11.96; Бюл. N 31).
Недостатками способа являются длительность и многостадийность процесса его получения, использование дорогостоящих импортных токсичных реактивов, что ограничивает организацию промышленного производства и ухудшает экологические условия процесса.
Полученные по этому способу иммуносорбенты имеют недостаточную специфическую емкость и чувствительность в иммуноанализах.
Известен способ получения иммобилизованной аминоацилазы, включающий ковалентное связывание фермента с активированным силохромом (а. с. СССР N 1060676, C 12 N 11/14; C 12 N 9/78; оп. 15.12.83, Бюл. N 46).
Силохром обрабатывают аминопропилтриэтоксисиланом и активируют n-бензохиноном. После включения лиганда готовый продукт дополнительно обрабатывают водным раствором глиоксаля с целью предотвращения диссоциации ацилазы и повышения стабильности иммуносорбента.
Недостатком способа является использование дефицитных дорогостоящих препаратов, что затрудняет организацию промышленного производства. Способ не предусматривает получения иммуносорбента с магнитными свойствами.
Целью изобретения является организация промышленного производства иммуносорбентов, в том числе и с магнитными свойствами, с повышенной специфической емкостью и чувствительностью за счет упрощения процесса, использование доступных и недорогих препаратов.
Поставленная цель достигается по двум вариантам.
По первому варианту способ получения иммуносорбентов включает модифицирование носителя, в качестве которого используют алюмосиликат, 0,3-0,4%-ным раствором полиглюкина, высушивание сорбента, активацию его вторичным алкилсульфатом натрия с последующим ковалентным связыванием с лигандом белковой природы.
По второму варианту способ получения иммуносорбентов включает модифицирование носителя, в качестве которого используют смесь алюмосиликата и магнитного порошка, 0,3-0,4%-ным раствором полиглюкина, высушивание сорбента, активацию его вторичным алкилсульфатом натрия с последующим ковалентным связыванием с лигандом белковой природы.
По отношению к прототипу, в качестве которого выбран способ получения иммуносорбента по а. с. СССР N 1517545, G 01 N 33/53, 15.12.93, Бюл. N 45-46, заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.
Использование в качестве носителя алюмосиликата, который является доступным мелкодисперсным наполнителем, представляющим собой комплексные анионы алюминия и кремния с избыточным отрицательным зарядом, который компенсирован щелочноземельными металлами. Носитель обладает повышенными адгезионными свойствами по сравнению с полиакриламидом и силохромами, что позволяет смешивать его с магнитным порошком без предварительной подготовки последнего.
Модифицирование носителя полиглюкином, который представляет собой полисахарид - линейный полимер на основе циклической формы глюкозы, где звенья связаны 1,6 - гликозидной связью. При обработке носителя на его поверхности образуется полимерная пленка, обеспечивающая повышение интенсивности последующей активации носителя и увеличение специфической емкости сорбента, а соответственно, и его чувствительность в иммуноанализах.
Активация вторичным алкилсульфатом натрия, представляющим собой анионное поверхностно-активное вещество создает на модифицированной поверхности сорбента активные группы, способные к химическому взаимодействию с остатками различных аминокислот белкового лиганда, что способствует повышению специфической емкости и чувствительности иммуносорбента.
Выбор заявляемых пределов концентрации полиглюкина является оптимальным, так, уменьшение его концентрации ниже 0,3% приводит к снижению специфической емкости и чувствительности иммуносорбента, а увеличение выше 0,4% уже нецелесообразно.
Все используемые по заявляемому способу препараты доступны и недороги, способ обеспечивает простую и достаточно экологически безопасную технологию получения иммуносорбентов, в том числе и с магнитными свойствами.
Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием полной совокупности заявляемых признаков.
Пример 1. (вариант 1). 2,5 г алюмосиликатного носителя суспендируют в 40 мл 0,4%-ного водного раствора полиглюкина и выдерживают при температуре 24oC 1 ч. Полученный сорбент высушивают при 100-110oC в течение 30 мин. К 1 г полученного препарата добавляют 12 мл 24%-ного раствора хлорида натрия и 1 мл вторичного алкилсульфата натрия, инкубируют смесь 1-2 ч при температуре (371)oC. К 1 мл активированного сорбента приливают 1 мл чумных иммуноглобулинов с концентрацией белка 3,5 мг/мл. Смесь оставляют при (371)oC в течение 1-2 ч, далее надосадочную жидкость удаляют, а иммуносорбент промывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия до "0" экстинции на спектрофотометре. Длительность получения иммуносорбента составляет 3-4 ч.
Результаты определения специфической емкости иммуносорбента проводят методом количественной иммунофлуоресценции (Владимцева И.В., Ефременко В.И., Климова И.М. и др. Лабораторное дело N 7, 1988, с.53-55). К 0,1 мл 10%-ного раствора иммуносорбента приливают 0,2 мл чумного микроба в концентрации 109-102 м. к./мл и инкубируют смесь 1 ч при 24oC. Далее иммуносорбент отмывают 50 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Вносят 0,2 мл иммуноглобулинов чумных люминесцирующих в рабочем разведении и инкубируют 30 мин. Отмывают сорбент 0,9%-ным раствором хлорида натрия и проводят регистрацию результатов в люминесцентном микроскопе Люмам Р-2 по общепринятой DASS-системе. Параллельно с опытной пробой измеряют люминесценцию контрольной пробы (иммуносорбент без контакта с чумным микробом). Специфическая емкость иммуносорбента выражается в условных единицах (у.е.), которые определяются отношением показателей интенсивности свечений опытной и контрольной проб. Измеренная таким образом емкость иммуносорбента составляет 10 у.е. Чувствительность метода составляет 102 м.к./мл чумного микроба.
Пример 2 (вариант 2). Смесь, состоящую из 2,5 г алюмосиликатного наполнителя и 0,5 г магнитного порошка, суспендируют в 40 мл 0,4%-ного водного раствора полиглюкина и далее выдерживают при температуре 24oC 1 ч. Полученный сорбент высушивают при 100-110oC в течение 30 мин. К 1 г полученного препарата добавляют 12 мл 24%-ного раствора хлорида натрия и 1 мл вторичного алкилсульфата натрия, инкубируют смесь 1-2 ч при температуре (371)oC. К 1 мл активированного сорбента приливают 1 мл чумных иммуноглобулинов с концентрацией белка 3,5 мг/мл. Смесь оставляют при (371)oC в течение 1-2 ч, далее надосадочную жидкость удаляют, а иммуносорбент промывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия до "0" экстинции на спектрофотометре. Длительность получения иммуносорбента составляет 3-4 ч.
Специфическая емкость иммуносорбента, измеренная методом иммунофлуоресценции, составляет 10 у.е. Чувствительность метода составляет 102 м.к./мл чумного микроба.
Пример 3. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования сорбента используют 0,4%-ный раствор полиглюкина. Специфическая емкость составляет 10 у. е. Чувствительность метода составляет 102 м.к./мл чумного микроба.
Пример 4. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования сорбента используют 0,3%-ный раствор полиглюкина. Специфическая емкость составляет 9 у.е. Чувствительность метода составляет 103 м.к./мл чумного микроба.
Пример 5. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но на последнем этапе синтеза к 1 мл активированного носителя приливают 1 мл туляремийных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 3,5 мг/мл. Специфическая емкость иммуносорбента составляет 10 у.е. Чувствительность метода составляет 102 м.к./мл туляремийного микроба.
Пример 6. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 2, но на последнем этапе синтеза к 1 мл активированного носителя приливают 1 мл холерных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 3,5 мг/мл. Специфическая емкость иммуносорбента составляет 10 у.е. Чувствительность метода составляет 102 м.к./мл холерного вибриона.
Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволит организовать простую, экологически безопасную технологию производства иммуносорбентов, в том числе и с магнитными свойствами, которые по специфической емкости в 3 раза и чувствительности в 100 раз превосходят аналогичные препараты, полученные по известным способам.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения иммуносорбента, включающий активацию носителя и ковалентное связывание с ним лиганда белковой природы, отличающийся тем, что в качестве носителя используют алюмосиликат, который модифицируют 0,3-0,4%-ным раствором полиглюкина и после высушивания активируют вторичным алкилсульфатом натрия.
2. Способ получения иммуносорбента, включающий активацию носителя и ковалентное связывание с ним лиганда белковой природы, отличающийся тем, что в качестве носителя используют смесь алюмосиликата с магнитным порошком, который модифицируют 0,3-0,4%-ным раствором полиглюкина и после высушивания активируют вторичным алкилсульфатом натрия.
Независимый научно технический портал
На главную страницу раздела
