СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОГЛОТИТЕЛЬНОЙ И МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ МЕТОДАМИ ФАГОЦИТОЗА И НСТ-ТЕСТА
(51) 7 G01N33/52
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие, но может быть восстановлен
--------------------------------------------------------------------------------
Документ: В формате PDF
(14) Дата публикации: 2005.03.27
(21) Регистрационный номер заявки: 2003104874/15
(22) Дата подачи заявки: 2003.02.19
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.02.19
(43) Дата публикации заявки: 2004.08.27
(45) Опубликовано: 2005.03.27
(56) Аналоги изобретения: МЕДВЕДЕВА А.Н. и др. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза. Лабораторное дело. 1991, №2, с. 19-20. RU 2115402 С1, 20.07.1998. RU 2127881 С1, 20.03.1999. САФРОНОВА В.М. и др. Функционально-метаболическая активность нейтрофилов крови при разных клинических формах бруцеллеза. Журн. микробиол. 1997, №1, с.61-63.
(72) Имя изобретателя: Гордиенко Г.И. (RU); Самсыгина Г.А. (RU); Дудина Т.А. (RU); Бородина Т.М. (RU)
(73) Имя патентообладателя: Российский государственный медицинский университет (RU)
(98) Адрес для переписки: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1, РГМУ, патентный отдел, С.В. Пыжеву
(54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОГЛОТИТЕЛЬНОЙ И МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ МЕТОДАМИ ФАГОЦИТОЗА И НСТ-ТЕСТА
Изобретение относится к области клинической иммунологии, в частности к исследованию факторов неспецифической антимикробной защиты, точнее к исследованию фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов периферической крови у детей. Гепаринизированную венозную кровь разливают в пять конических пробирок по 0,1 мл, первые три из которых содержат по 0,1 мл суспензии неокрашенного латекса с размером частиц 1,5 мкм, 4-я - 0,1 мл среды 199 и 0,1 мл 0,1% водного раствора нитросинего тетразолия (НСТ), 5-я - 0,1 мл суспензии латекса и 0,1 мл 0,1% водного раствора НСТ. Инкубируют в термостате при t 37°С: 1-ю пробирку - 5 мин, 2-ю - 30 мин, 3-ю - 1 час, 4-ю и 5-ю - 40 мин. Готовят из 0,2 мл инкубационной смеси мазки на стеклах, высушивают при t 37°С, фиксируют в пламени горелки, окрашивают 1% водным раствором метиленового синего, повторно высушивают и микроскопируют под иммерсией при увеличении 90х10. Результаты исследования оценивают по поглотительной активности в реакциях фагоцитоза, определяя процент фагоцитирующих клеток, фагоцитарное число, фагоцитарный интегральный индекс и показатели скорости фагоцитоза. Реакцию НСТ-теста определяют путем подсчета процента формазан-позитивных клеток, вычисления цитохимического показателя активности и индекса стимуляции НСТ-теста. Способ позволяет сократить время исследования, удешевить и повысить точность исследования. 1 ил., 3 табл.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Известен способ определения поглотительной активности нейтрофилов периферической крови с использованием в качестве тест-системы окрашенных частиц латекса диаметром 3 мкм (Медведев А.Н., Чаленко В.В. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лабораторное дело, 1991, №2, с.19-20).
Известен способ исследования реакций бактериального фагоцитоза нейтрофилами капиллярной крови (Нестерова И.В., Слынько Л.И., Светличная М.А., Майченко Л.Г. Диагностика изменений в микробицидной системе нейтрофильных гранулоцитов при аллергических заболеваниях / Методические рекомендации. Краснодар, 1989, с.11-12).
Известен способ исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови с использованием в качестве тест-системы лабораторного штамма Staphylococcus aureus P-209 (Park B.H., Fikrig S.M., Smithwich E.M. Infection and nitrobluetetrazolium reduction by neutrophils; a diagnostic aid // Lancet, 1968, vol.11, №2, p.532-534).
Существует также способ исследования метаболической активности нейтрофилов (Виксман М.Е., Маянский А.Н. Характеристика опсонических факторов по реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1980, т.89, №2, с.214-215).
Каких либо работ, описывающих определение поглотительной фазы фагоцитоза и метаболической активности нейтрофилов периферической крови в порядке одного исследования, в литературе не обнаружено.
Целью изобретения является оптимизация исследования, сокращение времени, удешевление и повышение его чувствительности.
Эта цель достигается тем, что гепаринизированную венозную кровь ребенка разливают в пять конических пробирок по 0,1 мл, первые три из которых содержат по 0,1 мл суспензии неокрашенного латекса с размером частиц 1,5 мкм, 4-я - 0,1 мл среды 199 и 0,1 мл 0,1% водного раствора нитросинего тетразолия (НСТ), 5-я - 0,1 мл суспензии латекса и 0,1 мл 0,1% водного раствора НСТ, инкубируют в термостате при t 37°С: 1-ю пробирку - 5 мин, 2-ю - 30 мин, 3-ю - 1 час, 4-ю и 5-ю - 40 мин; готовят из 0,2 мл инкубационной смеси мазки на стеклах, высушивают при t 37°С, фиксируют в пламени горелки, окрашивают 1% водным раствором метиленового синего, повторно высушивают и микроскопируют под иммерсией при увеличении 90×10, причем результаты исследования оценивают по поглотительной активности в реакциях фагоцитоза, определяя процент фагоцитирующих клеток, фагоцитарное число, фагоцитарный интегральный индекс и показатели скорости фагоцитоза, а реакцию НСТ-теста определяют путем подсчета процента формазан-позитивных клеток, вычисления цитохимического показателя активности и индекса стимуляции НСТ-теста.
Пример 1. Исследование поглотительной фазы фагоцитоза и метаболической активности нейтрофилов периферической крови было проведено у 36 практически здоровых детей в возрасте от 1 месяца до 5 лет. Первую группу составили 16 детей в возрасте до 1 года (средний возраст - 4,2±1,1 мес), вторую группу - 20 детей в возрасте от 1 года до 5 лет (2,9±1,8 лет). Зависимость показателей функциональной активности нейтрофилов периферической крови от возраста детей представлена в табл.1.
Таблица 1
Показатели фагоцитоза и НСТ-теста у здоровых детей
Показатель 1 группа(n=16) 2 группа (n=20) Достоверность различия
ФАГОЦИТОЗ
%Ф 5 мин 31,8±6,2 55,3±7,2 Р<0,05
ФЧ 5 мин 2,66±0,78 2,57±0,61
%Ф 30 мин 53,2±7,3 76,8±5,9 Р<0,05
ФЧ 30 мин 2,86±0,32 3,84±0,48 Р<0,05
%Ф 1 час 77,4±3,9 88,5±5,5 Р<0,05
ФЧ 1 час 4,47±0,98 6,69±0,81 Р<0,05
КФЧ1 0,72±0,08 0,68±0,06
КФЧ2 0,59±0,07 0,41±0,05 Р<0,05
ФИИ 2,01±0,51 2,94±0,55
Спонтанный НСТ-тест
%ПК 36,5±4,4 26,1±3,3 Р<0,05
ЦПА 0,97±0,09 0,62±0,03 Р<0,05
Стимулированный НСТ-тест
%ПК 50,0±5,8 44,3±5,6
ЦПА 1,46±0,11 1,28±0,17
ИСНСТ 1,51±0,12 1,84±0,10 Р<0,05
Исследование реакций фагоцитоза и НСТ-теста проводят параллельно, из одной порции биосубстрата, с применением идентичных реактивов, красителей, лабораторной посуды и оборудования.
В качестве тест-системы используют частицы неокрашенного латекса (10% полистирольная суспензия) диаметром 1,5 мкм производства фирмы ДИАэМ, Россия. При постановке НСТ-теста, кроме этого, используют нитросиний тетрозолий (НСТ) - С40Н30Сl2 N10О6 с молекулярным весом 817,65 производства Германии.
Методика фагоцитоза. Три конических пробирки, содержащих 0,1 мл суспензии латекса и 0,1 мл гепаринизированной венозной крови, инкубируют в термостате при 37°С (1-ю пробирку - 5 минут, 2-ю - 30 минут, 3-ю - 1 час). Готовят мазки инкубационной смеси на стекле, которые после высыхания, фиксации в пламени горелки, окраски 1% метиленовым синим микроскопируют при увеличении 90×10 под иммерсией. Учитывают данные на 100 нейтрофилов, из которых рассчитывают фагоцитарную активность (%Ф) - процент фагоцитирующих нейтрофилов; фагоцитарное число (ФЧ) - среднее количество частиц, захваченных одной клеткой, и фагоцитарный интегральный индекс (ФИИ) - среднее число поглощенных частиц латекса на 100 нейтрофилов. Высчитывают коэффициенты фагоцитарного числа (КФЧ), характеризующие скорость фагоцитоза: отношение ФЧ 5 мин к ФЧ 30 мин - КФЧ 1 и отношение ФЧ 5 мин к ФЧ 1 час - КФЧ 2.
Из той же порции крови одновременно с исследованием реакций фагоцитоза ставится НСТ-тест: 0,1 мл гепаринизированной крови и 0,1 мл 0,1% водного раствора НСТ инкубируют в конических пробирках при 37°С в течение 40 минут с 0,1 мл среды 199 - спонтанный НСТ-тест или с 0,1 мл суспензии латекса - стимулированный НСТ-тест. Аналогично приготовлению мазка для фагоцитоза готовят мазки: 0,2 мл инкубационной смеси наносят на стекло, просушивают, фиксируют, окрашивают 1% раствором метиленового синего, высушивают и микроскопируют под иммерсией при увеличении 90×10. Оценка НСТ-теста проводится по следующим показателям: % ПК - процент формазан-позитивных нейтрофилов; вычисляется индекса стимуляции НСТ-теста (ИС НСТ) - отношение % ПК в стимулированном НСТ-тесте к % ПК в спонтанном НСТ-тесте. С целью вычисления цитохимического показателя активности (ЦПА) проводят визуальную оценку количества гранул диформазана в нейтрофилах с использованием принципа Kaplow L.S. по формуле
где а, b, с, d, е - количество клеток соответственно 0, 1, 2, 3, 4-й степени.
Пример 2. Ребенок Р. Яна, 7 мес, поступила в отделение реанимации и интенсивной терапии Морозовской детской клинической больницы (МДКБ) по наряду скорой помощи из дома с диагнозом: Острая пневмония?, дыхательная недостаточность II степени. При обследовании в стационаре была выявлена острая полисегментарная деструктивная пневмония.
На 3-й, 10-й и 30-й день болезни ребенку было проведено исследование функциональной активности нейтрофилов (табл.2). Исследование проводилось аналогично примеру 1.
Таблица 2
Показатели функциональной активности нейтрофилов периферической крови ребенка Р. Яны, 7 мес.
Показатели 3-й день болезни 10-й день болезни 30-й день болезни Нормальные значения
ФАГОЦИТОЗ
%Ф 5 мин 27 70 32 31,8±6,2
ФЧ 5 мин 3,22 3,91 2,81 2,66±0,78
%Ф 30 мин 46 84 48 53,2±7,3
ФЧ 30 мин 3,26 6,83 3,74 2,86±0,32
%Ф 1 час 60 89 74 77,4±3,9
ФЧ 1 час 4,01 5,92 5,50 4,47±0,98
КФЧ1 0,79 0,83 0,73 0,72±0,08
КФЧ2 0,47 0,75 0,51 0,59±0,07
ФИИ 7,09 4,84 1,42 2,01±0,51
Спонтанный НСТ-тест
%ПК 28 60 34 36,5±4,4
ЦПА 0,52 0,97 0,88 0,97±0,09
Стимулированный латексом НСТ-тест
%ПК 34 87 55 50,0±5,8
ЦПА 1,84 2,20 1,55 1,46±0,11
ИСНСТ 1,21 1,45 1,62 1,51±0,12
- достоверность различия с нормальными значениями Р<0,05.
При исследовании зависимости показателей фагоцитоза от времени инкубации было установлено, что % Ф и ФЧ достоверно увеличиваются во времени, достигая максимальных значений к 1 часу. При дальнейшей инкубации показатели фагоцитарной активности не меняются. На чертеже представлена зависимость показателя %Ф нейтрофилов от времени инкубации в минутах. Очевидно, что длительная инкубация, предлагаемая в некоторых методиках, при исследовании поглотительной фазы фагоцитоза с применением в качестве тест-системы частиц латекса не рациональна. Инкубация в течение 1 часа является достаточной для достоверной оценки фагоцитарной активности нейтрофилов, одновременно сокращая временные затраты на проведение исследования.
Установлено, что для одновременного исследования поглотительной фазы в реакциях фагоцитоза и кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови методом НСТ-теста рационально использовать неокрашенный латекс с диаметром частиц 1,5 мкм. Использование более крупных и/или окрашенных частиц латекса затрудняет визуальную оценку стимулированного НСТ-теста по принципу Kaplow. Более мелкие частицы латекса захватываются нейтрофилами в значительном количестве (20-30 частиц на одну клетку), что затрудняет подсчет с применением обычного светового микроскопа.
Установлено влияние формы дна пробирки - круглой и конической. В конических пробирках наблюдаются более высокие значения как показателей фагоцитоза, так и НСТ-теста. По-видимому, повышение показателей функциональной активности нейтрофилов обусловлено влиянием короткодистанционного взаимодействия. Это послужило критерием выбора лабораторной посуды, как было отмечено в примере 1, при проведении исследования используются пробирки конической формы.
В ходе проведенного исследования зависимости поглотительной способности и метаболической активности нейтрофилов от различных стабилизаторов крови установлено, что трилон Б (динатриевая соль ЭДТА), в отличие от гепарина подавляет фагоцитоз, снижает кислородзависимый метаболизм нейтрофилов.
Пример 3. Ребенок С. Филипп, 5 лет, поступил в 8 отделение МДКБ с диагнозом: правосторонняя полисегментарная пневмония. Исследование фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов периферической крови было проведено на 4-й день и на 22-й день заболевания по методике, описанной в примере 1 (табл.3).
Таблица 3
Показатели функциональной активности нейтрофилов периферической крови ребенка С. Филиппа, 5 лет
Показатель 4-й день болезни 22-й день болезни Нормальные значения
ФАГОЦИТОЗ
%Ф 5 мин 80 63 55,3±7,2
ФЧ 5 мин 2,7 2,31 2,57±0,61
%Ф 30 мин 97 79 76,8±5,9
ФЧ 30 мин 5,43 3,59 3,84±0,48
%Ф 1 час 98 89 88,5±5,5
ФЧ 1 час 4,84 5,99 6,69±0,81
КФЧ1 0,51 0,64 0,68±0,06
КФЧ2 0,56 0,51 0,41±0,05
ФИИ 5,27 3,31 2,94±0,55
Спонтанны и НСТ-тест
%ПК 73 30 26,1±3,3
ЦПА 1,73 0,62 0,62±0,03
Стимулированный латексом НСТ-тест
%пк 69 52 44,3±5,6
ЦПА 1,70 1,33 1,28±0,17
ИСНСТ 0,94 1,74 1,84±0,10
- достоверность различия с нормальными значениями Р<0,05.
Настоящее изобретение не очевидно для специалиста, работающего в области клинической иммунологии и педиатрии. Определение поглотительной фазы фагоцитоза и метаболической активности нейтрофилов периферической крови в порядке одного исследования ранее не проводилось, сама постановка такого вопроса казалась абсурдной. Новизна изобретения заключается в возможности проведения в порядке одного исследования двух методов с использованием одной порции биосубстрата (кровь), идентичных реактивов и оборудования. Это позволяет оптимизировать метод, делает его доступным у детей раннего возраста и новорожденных, повышает его информативность. Объединение двух разных методик потребовало длительных исследований и кропотливого труда по подбору оптимальных условий, позволяющих одновременно с экономией времени, реактивов и меньшей инвазивностью, обеспечить высокую информативность исследования.
Заявленный способ имеет важное социальное и экономическое значение. Он позволяет экономить время и реактивы, не требует дорогостоящего оборудования, создает ранее неизвестную возможность обследования детских коллективов с выявлением неожиданных результатов, которые могут быть положены в основу диагностики различных патологических состояний. Применение оборудования стандартной клинической лаборатории приводит не только к снижению материальных затрат, но и открывает перспективу внедрения предложенного исследования для изучения параметров неспецифического иммунитета в амбулаторных условиях. Снижение трудовых затрат, экономия времени создает потенциальную возможность проведения исследования как скрининг-теста при обследовании различных детских коллективов, что неизвестно специалистам, работающим в области клинической иммунологии и педиатрии.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ исследования поглотительной и метаболической активности нейтрофилов периферической крови у детей методами фагоцитоза и НСТ-теста, отличающийся тем, что гепаринизированную венозную кровь разливают в пять конических пробирок по 0,1 мл, первые три из которых содержат по 0,1 мл суспензии неокрашенного латекса с размером частиц 1,5 мкм, 4-я - 0,1 мл среды 199 и 0,1 мл 0,1% водного раствора нитросинего тетразолия (НСТ), 5-я - 0,1 мл суспензии латекса и 0,1 мл 0,1% водного раствора НСТ, инкубируют в термостате при t 37°С: 1-ю пробирку - 5 мин, 2-ю - 30 мин, 3-ю - 1 ч, 4-ю и 5-ю - 40 мин; готовят из 0,2 мл инкубационной смеси мазки на стеклах, высушивают при t 37°С, фиксируют в пламени горелки, окрашивают 1% водным раствором метиленового синего, повторно высушивают и микроскопируют под иммерсией при увеличении 90х10, причем результаты исследования оценивают по поглотительной активности в реакциях фагоцитоза, определяя процент фагоцитирующих клеток, фагоцитарное число, фагоцитарный интегральный индекс и показатели скорости фагоцитоза, а реакцию НСТ-теста определяют путем подсчета процента формазан-позитивных клеток, вычисления цитохимического показателя активности и индекса стимуляции НСТ-теста.
Независимый научно технический портал
На главную страницу раздела
