СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ Clr2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
(51) 7 G01N33/573
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие, но может быть восстановлен
--------------------------------------------------------------------------------
(14) Дата публикации: 2004.08.27
(21) Регистрационный номер заявки: 2003110058/15
(22) Дата подачи заявки: 2003.04.09
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.04.09
(45) Опубликовано: 2004.08.27
(56) Аналоги изобретения: SCHUMAKER V.N. et al A molecular mechanism for the activation of the first component by immune complex, Mol Immunol, 1986, May 23(5), p. 557-565. RU 2144676 C1, 20.01.2000. US 5650389, 22.07.1997.
(72) Имя изобретателя: Козлов Л.В. (RU); Колесникова Е.А. (RU); Дьяков В.Л. (RU); Лахтин В.М. (RU)
(73) Имя патентообладателя: Государственное учреждение "Московский научно- исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского (RU)
(98) Адрес для переписки: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, ГУ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, патентный отдел
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ Clr2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
Изобретение относится к области медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности факторов комплемента в сыворотке крови человека, и может быть использовано при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Сущность изобретения состоит в том, что сорбируют неспецифический иммуноглобулин G, вносят раствор, содержащий сыворотку морской свинки и этилендиаминтетраацетат натрия, после инкубации и осушения планшета вносят анализируемую пробу, содержащую комплекс С1r2s2 комплемента человека с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки крови человека, буферный раствор, содержащий ионы кальция и магния, проводят инкубацию и после отмывки и осушения планшета в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С4 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности комплекса С1r2s2 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего определять функциональную активность комплекса С1r2s2 комплемента человека. 1 табл.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Субкомпоненты С1r и C1s, синтезируемые в организме в равных количествах и представляющие собой зимогены протеиназ, образуют прочный Са-зависимый тетрамерный комплекс Clr2s2, связанный с субкомпонентом C1q также Са-зависимым образом и формирующий с ним компонент С1. При связывании С1 с иммунным комплексом происходит активация протеиназ С1r и C1s. Активация этих ферментов - существенный этап инициации каскада активации комплемента по классическому пути, поэтому их функциональный дефицит может быть причиной различного рода патологических состояний организма.
Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание как антигена. Тем не менее, наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. На уровне техники не известны источники информации, касающиеся определения функциональной активности комплекса С1r2s2 субкомпонентов комплемента, пригодные для клинической практики до настоящего времени не известны.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего определять функциональную активность комплекса С1r2s2 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина G, затем внесения в лунки микропланшета сыворотки морской свинки в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для связывания ионов кальция и сорбции на иммуноглобулине субкомпонента C1q. После освобождения лунок микропланшета от жидкости и их промывки в лунки вносят буферный раствор с ионами кальция, анализируемые пробы, содержащие комплекс С1r2s2 с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при рН 5,5) в качестве источника компонента С4. При проведении инкубации для активации комплемента происходит ковалентное связывание С4b на сорбированном иммуноглобулине в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого комплекса C1r2s2. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С4 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С4 -фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного комплекса C1r2s2 активировать С4 с образованием С4b, количество которого определяется по его количеству, связавшемуся в лунках. Тем самым достигается определение функциональной активности С1r2s2 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности комплекса Clr2s2 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов.
Пример. Определение функциональной активности препарата С1r2s2
Растворяют иммунохимически чистый IgG в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях белка 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4С. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4 (VBSE), содержащим 0,15 М NaCl, 50 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора VBSE и 15 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37С и отмывки вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са2+ и 0,5 мМ Mg2+ (VBS2+), в лунки планшета вносят по 100 мкл раствора VBS2+, содержащего 15 мкл псевдоглобулиновой фракции сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при рН 5,5) и анализируемую пробу, содержащую комплекс C1r2s2 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъютата пероксидазы с антителами против компонента С4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37С, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерения светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата комплекса С1r2s2 рассчитывают по стандартной кривой. Этим методом проведено определение активности комплекса С1r2s2 в 6 образцах. Полученные результаты приведены в таблице.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ определения функциональной активности комплекса Сlr2s2 комплемента человека, характеризующийся тем, что в лунках микропланшета сорбируют неспецифический иммуноглобулин G, затем вносят раствор, содержащий сыворотку морской свинки и этилендиаминтетраацетат натрия, после инкубации и осушения планшета вносят анализируемую пробу, содержащую комплекс Сlr2s2 комплемента человека с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки крови человека, получаемую диализом против дистиллированной воды, а также буферный раствор, содержащий ионы кальция и магния, проводят инкубацию и после отмывки и осушения планшета в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С4 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности комплекса Сlr2s2 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.
Независимый научно технический портал
На главную страницу раздела
