СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ПРОЦЕССА В ОРГАНИЗМЕ
(51) 5 G01N33/53
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 10.08.2007 - прекратил действие
--------------------------------------------------------------------------------
(14) Дата публикации: 1994.10.15
(21) Регистрационный номер заявки: 5013169/14
(22) Дата подачи заявки: 1991.08.27
(45) Опубликовано: 1994.10.15
(56) Аналоги изобретения: Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. -М.: Наука, 1975.
(71) Имя заявителя: Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
(72) Имя изобретателя: Франциянц Е.М.; Сидоренко Ю.С.; Розенко Л.Я.
(73) Имя патентообладателя: Франциянц Елена Михайловна; Сидоренко Юрий Сергеевич; Розенко Людмила Яковлевна
(54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ПРОЦЕССА В ОРГАНИЗМЕ
Использование: биохимические исследования в экспериментальной онкологии для выявления биохимических механизмов развития канцерогенеза, позволяющих проводить диагностику злокачественных заболеваний. Повышение точности диагностики онкологического заболевания и определение наличия условий для возникновения рака достигается тем, что определяют в крови содержание железозависимых, органосодержащих, антителоподобных РФ-белков, обладающих ложной СОД-активностью и иммуномаскирующими свойствами, обязательно выходящих в гуморальную среду, на фоне снижения уровня витаминов А и Е на 50 и более процентов, и последовательного подавления активности антиоксидантных ферментов. Положительный эффект использования способа заключается в том, что обнаружение в гуморальной среде уровня РФ-белков служит дифференциальной диагностикой для злокачественного процесса. Анализ показателей "биохимической среды" позволяет предложить новые подходы к диагностике, лечению и прогнозу эффективности терапии. Способ не требует больших материальных затрат, прост по выполнению.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к медицине, в частности биохимическим исследованиям в экспериментальной онкологии, и может быть использовано для выявления биохимических механизмов развития канцерогенеза, позволяющих проводить диагностику онкологических заболеваний.
Известно, что при процессе регуляции размножения клеток, канцерогенезе и опухолевом росте, антиокислительная активность липидов играет важную роль. В ходе свободнорадикальных реакций образуются депрессоры клеточного размножения, а индуцирование опухолей как с помощью канцерогенных химических соединений, так и при воздействии облучения, протекает со стадийным изменением антиокислительной активности липидов.
Однако известная концепция не дает детализации "биохимической среды" организма после контакта его с канцерогенами до выхода опухоли и не объясняет многих патогенетических моментов образования злокачественных опухолей. Нет объяснений относительно работы протоонкогенов, появления эмбриональных белков в организме больного, не свойственных имеющейся у них локализации опухоли - процессов цитодифференцирования. В определенных условиях опухолевая клетка может нормализоваться и принимать участие в жизнедеятельности всего организма.
Известно, что в сыворотке крови и клетках нелимфоидного ряда, путем иммуноферментного метода, были найдены так называемые, Р-белки, которые обладают супероксиддисмутазной активностью. Повышенное содержание Р-белков обнаружено в сыворотке крови людей при различных воспалительных и инфекционных состояниях, показана смесь их количества с тяжестью патологического процесса.
Однако исследование Р-белков находится в начальной стадии. Неизвестно их строение, биосинтез, биологические функции и, главное, их участие в процессе канцерогенеза.
Целью изобретения является определение возникновения злокачественного процесса в организме.
Поставленная цель достигается тем, что регистрируют величины биохимических показателей в биологическом материале, в качестве биологического материала используют кровь, а в качестве биохимических показателей содержание в крови витаминов А, Е и белков, обладающих ложной СОД - активностью, железозависимых и антителоподобных.
Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с известными позволяет сделать вывод о существенности отличий и достижения технического результата, заявленного в задаче изобретения, т.е. выявляет наличие корреляции между наличием злокачественности в организме и исследуемыми показателями.
Теоретическое обоснование представленного "Способа исследования возникновения злокачественного процесса в организме", следующее:
В динамике химического канцерогенеза перекисного метаболизма организма происходит перестройка организма на эволюционно более древний (эмбриональный) путь, обуславливающий малигнизацию нормальных клеток с последовательным подавлением неферментативной, а затем ферментативной, антиокислительных систем с обязательным выходом в гуморальную среду органоспецифических железосодержащих антителоподобных белков, обладавших неферментативной СОД-активностью. Момент совпадения перестройки биохимической среды на эволюционно древний путь с действием любого специфического канцерогена приводит к малигнизации нормальной клетки и запуску процесса канцерогенеза.
Пример конкретного применения "Способа исследования возникновения злокачественного процесса в организме".
На известной модели развития опухоли, экспериментально индуцированной химическим канцерогеном, мы проанализировали комплекс изменений параметров антиокислительной системы, как ферментативного, так и неферментативного ее компонента. Экспериментальная часть работы выполнена на 450 крысах линии Вистар, методика постановки эксперимента и методы биохимического исследования традиционны: изоферменты супероксиддисмутазы (СОД) в тканях, сыворотке и лизатах крови (Beaucherirp C., Prdovirch I., Superoxide dismutase. Improved assays and assay applicable to serlamide gale// Anal. Biochemical. 1971. 44 - p. 276-281/. содержание витаминов А и Е в крови (Черняускене Р. Ч. , Вериничене З.З., Грибаускас П.С.). Одновременное определение концентраций витаминов Е и А в сыворотке крови. (Лаб. дело, - 1984, N 6, с. 362-385) общую активность СОД. (Reiner Pried. Enaymatic and nonenayma tie assay of superoxide dismutase //Biochemic, 1975, 57-P, p. 657-660, активность глютатионпероксидазы и глютатионредуктазы (Hakamura W. Hoasoda B. The absence of glucosa in Eirlich scutes tumor cells arkifluid/. Biochemic., Biophys., Acta, - 1968-, -156-. -2- P., 212-218/.
Гаврилова А.Д., Хмара Н.Р, определение активности глутатионпероксидазы эритроцитов при насыщающих концентрациях субстрата. Лаб. дело, - 1986. - 12. - с. 721-724; активность глютатионтрансферазы /Stont B.L., Becker P.P., Xenobichtic Metabolieting Enzymes in Genetically Initiated Mouse Lever. Tumore.// Cancer Recearch. - 1976, - 46, -6, -P. 2693-2696.
На модели химического канцерогенеза мы фактически проследили изменение процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в крови и тканях органов, в которых в дальнейшем опухоль не развивалась и не возникала, от момента контакта канцерогенеза (3,4-бензпирена) с организмом интактного животного до момента выхода опухоли. Таким образом мы проанализировали, какая "биохимическая среда" способствовала возникновению опухолевого процесса.
Данные содержания витаминов Е и А в крови и органах крыс, активность глутатион - трансферазы и глутатионпероксидазы крови и немалигнизирующихся органов (печени и легких) крыс в динамике канцерогенеза.
Установлено, что начальные этапы канцерогенеза (1-2 недели), сопровождаются резким снижением содержания витамина Е и А в мембранах эритроцитов и тканях немалигнизирующихся органов (печени и легких). Так, витамин Е снижался в плазме в 3,1 раза, в эритроцитах, - 2,4 раза, в печени - в 4 раза, в легких в 3 раза, Учитывая факт наибольшего падения содержания витамина Е и А в печени, можно предположить, что в первые 1-2 недели канцерогенеза происходит резкое нарушение синтеза этих веществ, так как они, в основном, синтезируются в печени.
В этой связи наблюдается падение перекисной резистентности эритроцитарных мембран. В эти же сроки наблюдается экстремальное возрастание с последующим падением активности глутатионпероксидазы в эритроцитах и легких, а также глутатионтрансферазы в эритроцитах. С 1-2 недели отмечено снижение активности каталазы плазмы и эритроцитов до 96,75,3 оя/мл и 1,70,2 ед/л при контрольных значениях 123,37,5 оя/мл и 2,70,1 ед/л соответственно. Изменение активности фермента в печени и в легких в эти сроки не обнаружено.
В печени и легких найдено возрастание и резкое падение активности глутатионпероксидазы и глютатионтрансферазы, аналогичное отмеченному ранее в эритроцитах. В плазме крови и эритроцитах происходит дальнейшее снижение активности каталазы (57,44,1 ед/мл и 1,30,1 ед/мл, соответственно).
Все дальнейшие сроки исследования, вплоть до 17 недели, характеризуются постепенным подавлением активности ферментов антиокислительной защиты и прогрессивным снижением витаминов Е и А в эритроцитах и немалигнизирующихся органах.
В предопухолевый период канцерогенеза (12-22 недели) наблюдается снижение активности каталазы в плазме и эритроцитах до 57,24,3 ед/мл и 1,00,07 ед/мл, соответственно (р < 0,01); 1Т в эритроцитах, на 67%; ПРЗ - на 43% ; витаминов - Е и А в плазме и эритроцитах, соответственно в 4 и 2 раза и в 8 и 4 раза по сравнению с интактными животными. Наблюдается резкое снижение содержания витаминов Е в печени и легких в 20 и 7 раз, соответственно, и витамина А - в 14 раз и 13 раз, соответственно ниже контроля. Во всех тканях снижена активность антиокислительных ферментов.
Таким образом, очевидно, что момент выхода опухоли у животных происходит на фоне чрезвычайно низкого содержания сульфгидрильных групп, витаминов Е и А, подавления ферментов антиокислительной защиты и детоксикации канцерогенов, выраженных структурно-функциональных повреждений в биомембранах организма. Вышеуказанные изменения являются итоговыми для собственно манифестации опухоли.
Анализируя же самые начальные моменты канцерогенеза, считаем необходимым выделить первично достоверность снижения содержания витаминов Е и А в мембранах клеток всего организма, и дискоординацию в системе антиокислительной защиты - ПОЛ , не затрагивающую пока структурно-функциональную целостность мембран. Обнаруженные в этот период изменения мы рассматриваем как стрессорную реакцию организма на канцерогенную интоксикацию, что подтверждается реакцией антиокислительных ферментов, еще одной функцией которых является участие в системе детоксикации ксенобиотиков и резким подъемом общей пероксидазной активности крови.
Таким образом, очевидно, что в первые 1-2 недели канцерогенеза, мембраны клеток фактически лишаются антиоксидантной защиты и становятся подверженными действию повреждающих факторов. Учитывая тот факт, что биологические мембраны являются двойным модификатором передачи информации от сигнального вещества в клетку и определяют эффективность перестройки метаболизма в ответ на такое воздействие, понятным становится необходимость поддержания их структурной и функциональной целостности. Установленный нами факт "потери" системы антиокислительной защиты на ранних этапах канцерогенеза является абсолютно новым звеном в цепи реакций, приводящих к росту опухоли. До сих пор считалось, что уменьшение содержания витаминов Е и А в организме происходит за счет перекачивания их в растущую опухоль для ее быстрого деления и увеличения массы. В нашем исследовании мы имеем дело с организмом, в котором еще нет опухоли и до ее выхода еще много времени. Поэтому полученные результаты мы трактуем иначе.
Известно, что витамины Е и А являются веществами, структурно связанными с биомембраной и поддерживающими ее конформацию. С другой стороны известны механизмы их действия как противоопухолевых агентов. Так витамин А препятствует связыванию канцерогенов с ДНК клетки, оказывает нормализующее действие на фенотип трансформированных клеток, вызывая их обратное развитие, обеспечивает дифференцировку опухолевых клеток. Известно также участие витаминов А и Е в увеличении массы лимфоидных органов, увеличении в них числа лимфоцитов и стимулировании противоопухолевого иммунитета. Таким образом, "потеря" организмом таких важных веществ может с одной стороны привести к нарушению работы иммунной системы, которая перестает распознавать трансформированные клетки, с другой - модифицировать мембраны и изменять чувствительность их рецепторов к действию медиаторов центральной регуляции.
В динамике химического канцерогенеза, индуцированного 3,4-бензпиреном, нами, кроме того, было проведено электрофоретическое изучение лизатов форменных элементов крови, сыворотки крови, гомогенатов печени в легких крыс линии Вистар. Опыт проводили начиная также с первой недели канцерогенеза, вплоть до выхода опухоли на 22-23-ей неделе.
До сих пор считалось, что в крови животных и человека присутствует одна изоформа супероксиддисмутазы - медь-цинк- содержащая СОД. Она выявлялась в системе хлороформ-этанол.
Мы изменили смесь для выявления активности СОД - трис HCl, буфер (рН 7,8) и тритон х-100 в конечной концентрации 0,1%. При исследовании эритроцитов крови интактных животных было обнаружено присутствие двух фракций инактивации супероксиданион радикала. Путем ингибиторного анализа с помощью азида циамида, диэтилдитиокарбоната натрия и анти- Р-реагента, представляющего собой антисыворотку и эпимембранным участком клеточных рецепторов, фракции были идентифицированы.
Установлено, что один пик дисмутирующей активности принадлежит медь-цинксодержащей изофермы СОД, а другой - ингибируется только с помощью анти-Р-реагентов. Этот пик мы расцениваем как изоферму Р-белков - продуктов катаболитного распада клеточных рецепторов.
Кинетический анализ найденной фракции белков показал, что они носят "сорбционный" неферментативный характер дисмутации.
Для доказательства связи электрофоретического пика СОД-активности белков с клеточными рецепторами, мы с помощью дискоэлектрофореза изучали лизаты и супернатант культуральной жидкости нативных и подвергнутых термическому шоку клеток крови с параллельным проведением указанного выше ингибиторного анализа, Лизаты эритроцитов получали, применяя хлороформ-этанольный реагент, смесь, содержащую тритон х-100. Найдено, что при диск-электрофорезе этанольные экстракты имеют одну полосу СОД-активности, которая соответствует мель-цинксодержащей изоферме фермента. Лизаты, полученные с помощью детерагента, имели два пика дисмутирующей активности - медь-цинксодержащую СОД и Р-белки. В супернатанте культуральной жидкости нативных эритроцитов выявлялась одна полоса ферментативной СОД. После термошока в обоих видах лизатов эритроцитов наблюдалось по одной полосе дисмутазной активности, тогда как в культуральной жидкости их стало две. По форетическим характеристикам дополнительная фракция, появившаяся в культуральной жидкости клеток, подвергнутых термошоку, совпадала с фракцией "тритонового лизата" нативных эритроцитов, исчезнувших после термического воздействия. С помощью ингибиторного анализа было показано, что после термошока в культуральную среду переходят фракции Р-белков.
Итак, после температурного воздействия происходит сбрасывание эпимембранных клеточных образований в культуральную среду. Полученные результаты согласуются с данными литературы о высокой лабильности рецепторного аппарата клетки, способности "сбрасывать" эпимембранные участки клеточных рецепторов в ответ на патологическое воздействие.
Таким образом, было установлено, что в эритроцитах интактных животных, наряду с медь-цинксодержащим ферментом СОД, присутствуют белки, способные дисмутировать супероксиданион радикал по "сорбционному" типу, т.е. по типу, присущему более древним формам жизни.
В лимфоцитах и нейтрофилах крови интактных животных мы нашли только медь-цинкзависимую СОД. В легких и печени интактных животных, наряду с истинным ферментом (медь-цинксодержащей СОД) были найдены небольшие пики активности, обусловленные Р-белками. В сыворотке и плазме крови интактных животных эта фракция не обнаружена.
Начиная с первой недели канцерогенеза, в сыворотке крови животных были обнаружены фракции, обладающие супероксид- дисмутазной активностью, которые сохранялись вплоть до выхода опухоли. Ингибиторный анализ, проведенный с помощью 5 мм азида, цианида и диэтилдитиокарбамата, не изменял характер и величину пиков, дисмутирующих супероксиданион радикал в сыворотке крови животных во все последующие сроки. Найденные пики СОД-активности ингибировались только анти-Р- реагентом, причем концентрации анти-Р-реагента от 1:1 по 1: 150 полностью устраняла найденные электрофоретические пики дисмутазной активности, при концентрации 1:200 - 1:250 пики на фореграммах постепенно восстанавливались до первоначального вида. Указанные опыты позволили нам идентифицировать найденную фракцию как Р-белки. Окраска гелевых столбиков позволила установить, что в зоне локализации белков появляется большое содержание двухвалентного железа. Следовательно, мы имели возможность считать, что найденные белки содержат железозависимую СОД.
Кинетический анализ показал, что СОД-активность Р-белков носит "псевдодисмутазный" характер и не относится к ферментативной, а выступает в качестве "ловушки" анион-радикала. Логично стало предположить, что найденные белки сыворотки крови представляют собой продукты катаболитного распада клеточных рецепторов, сброшенных с эритроцитов, так как при термошоке эритроцитов в культуральной жидкости определялась аналогичная электрофоретическая картина.
В динамике химического канцерогенеза наблюдались характерные сдвиги в электрофоретическом спектре гомолизатов печени и легких. В лизатах эритроцитов, начиная с 5-ой недели канцерогенеза, отмечается увеличение пика СОД-активности белков и резкое увеличение пика СОД-активности медь-цинкзависимого фермента. Аналогичные качественные изменения отмечались в печени и легких с 9 недели химического канцерогенеза: резко возросли пики активности Р-белков. В лимфоцитах и нейтрофилах крови, начиная с 9-ой недели канцерогенеза, выявляющийся один пик СОД-активности перестает ингибироваться с помощью специфических для истинного медь-цинк-содержащего фермента ингибитора и ингибируется только анти-Р-реагентом. Кинетический анализ показывает "сорбционный" характер дисмутирующей активности, т.е. происходит "замена" инактивации супероксиданион радикалов в этих клетках крови.
Найденная перегруппировка дисмутазной активности в форменных элементах крови и тканях животных сохраняется в дальнейшем во все исследуемые сроки, вплоть до выхода опухоли на 22-23 неделе.
Таким образом, опухоль еще не появилась, а "биологическая среда" для ее развития уже подготовлена; подавлен естественный каскад антиокислителей и в организме мощно работает "ловушка" свободно-радикальных форм кислорода, подменившая истинную ферментативную активность.
Такая форма утилизации метаболитов кислорода характерна для древних эволюционных форм жизни. Следовательно, в процессе канцерогенеза организм перестраивается на эволюционно древний путь перекисного метаболизма: он весь "молодеет" до "древности" и на этом фоне происходит "выход" опухоли.
Технический результат "Способа исследования возникновения злокачественного процесса в организме" заключается в том, что обнаружение в гуморальной среде уровня Р-белков по предлагаемой авторами методике, служит дифференциально- диагностическим тестом злокачественного процесса. Анализ показателей "биохимической среды" позволяет предложить новые методы диагностики, способы лечения и прогноза эффективности терапии. Способ не требует больших материальных затрат.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ПРОЦЕССА В ОРГАНИЗМЕ, включающий регистрацию величины биохимических показателей в биологическом материале, отличающийся тем, что в качестве биологического материала используют кровь, а в качестве биохимических показателей содержание в крови витаминов А, Е и белков, обладающих ложной СОД-активностью, железозависимых и антителоподобных.
Независимый научно технический портал
На главную страницу раздела
