МУТАЦИИ ГЕНА МТS В ЗАРОДЫШЕВОЙ ЛИНИИ И СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМ ОПУХОЛЯМ В ГЕНЕ МТS
(51) 7 G01N33/53, C12N15/28, C12Q1/68, C07H21/04
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 10.08.2007 - прекратил действие
--------------------------------------------------------------------------------
(14) Дата публикации: 2000.12.27
(21) Регистрационный номер заявки: 95122080/14
(22) Дата подачи заявки: 1995.03.17
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1995.03.17
(31) Номер конвенционной заявки: 214,582
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1994.03.18
(33) Страна приоритета: US
(31) Номер конвенционной заявки: 215,086
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1994.03.18
(33) Страна приоритета: US
(31) Номер конвенционной заявки: 215,087
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1994.03.18
(33) Страна приоритета: US
(31) Номер конвенционной заявки: 227,369
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1994.04.14
(33) Страна приоритета: US
(31) Номер конвенционной заявки: 251,938
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1994.06.01
(33) Страна приоритета: US
(45) Опубликовано: 2000.12.27
(56) Аналоги изобретения: US 5021551, 04.06.1991. WO 92/00757, 21.01.1992.
(71) Имя заявителя: ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ФОНД УНИВЕРСИТЕТА ЮТЫ, (US); МИРИАД ДЖЕНЕТИКС, ИНК. (US)
(72) Имя изобретателя: СКОЛЬНИК Марк Х. (US); КЕННОН-ЭЛБРАЙТ Лайза А. (US); КЭМБ Александр (US)
(73) Имя патентообладателя: ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ФОНД УНИВЕРСИТЕТА ЮТЫ, (US); МИРИАД ДЖЕНЕТИКС, ИНК. (US)
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 1995.12.18
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: US 95/03537 (17.03.1995)
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 95/25813 (28.09.1995)
(98) Адрес для переписки: 119034, Москва, Пречистенский переулок 14, стр.1, 4 этаж, "Гоулингз Интернэшнл Инк.", Дементьеву В.Н.
(54) МУТАЦИИ ГЕНА МТS В ЗАРОДЫШЕВОЙ ЛИНИИ И СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМ ОПУХОЛЯМ В ГЕНЕ МТS
Изобретение относится к области медицинской генетики, в частности к соматическим мутациям в гене многофункционального опухолевого супрессора (MTS) в случае неоплазий человека и использованию этих мутаций для диагностики и прогнозирования указанных заболеваний. Изобретение также относится к мутациям гена MTS в зародышевой линии и использованию данных мутаций для диагностики предрасположенности к таким формам рака, как меланома, окулярная меланома, лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина, множественная миелома, саркома, миосаркома, холангиосаркома, чешуеклеточная карцинома, хронический лимфоидный лимфолейкоз, а также опухоли поджелудочной железы, молочной железы, мозга, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичников, матки, семенников, почек, желудка, ободочной и прямой кишки. Изобретение также имеет отношение к терапии тех неоплазий человека, при которых произошла мутация в гене MTS, включая генотерапию, заменяющую белковую терапию и использование белковых миметиков. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для скрининга препаратов в целях терапии опухолей. 5 с. и 28 з.п. ф-лы, 17 ил., 9 табл.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к соматическим мутациям в гене многофункционального опухолевого супрессора (MTS) в случае неоплазий человека и использованию этих мутаций для диагностики и прогнозирования указанных заболеваний. Изобретение также относится к мутациям гена MTS в зародышевой линии и использованию данных мутаций для диагностики предрасположенности к таким формам рака как меланома, окулярная меланома, лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина, множественная миелома, саркома, миосаркома, холангиосаркома, чешуеклеточная карцинома, хронический лимфоидный лимфолейкоз (CLL), а также опухоли поджелудочной железы, молочной железы, мозга, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичников, матки, семенников, почек, желудка, ободочной и прямой кишки. Изобретение также имеет отношение к терапии тех неоплазий человека, при которых произошла мутация в гене MTS, включая генотерапию, заменяющую белковую терапию и использование белковых миметиков. Наконец, изобретение относится к скринингу препаратов для терапии опухолей.
Публикации и другие материалы, использованные для описания уровня техники, и в особенности случаи из практики включены в настоящую заявку в качестве ссылок, на них имеются указания в последующем тексте и соответственно к описанию изобретения приложен список публикаций.
Генетика рака сложна и включает в себя многочисленные доминантные, позитивные регуляторы трансформированного состояния (онкогены), так же как и многочисленные рецессивные, негативные регуляторы (гены-супрессоры опухолей). Охарактеризовано более ста онкогенов. Идентифицировано менее дюжины генов-супрессоров, но ожидается что их число превысит пятьдесят (Knudson, 1993).
Участие столь многих генов подчеркивает сложность механизмов контроля роста, функционирующих в клетке для поддержания целостности нормальной ткани. Эта сложность проявляется и другим образом. Так, показано, что ни один из онкогенов не участвует в развитии всех или хотя бы большинства неоплазий человека. Наиболее часто встречающимися онкогенными мутациями являются мутации гена H-ras, обнаруживаемые в 10-15% всех солидных опухолей (Anderson et al., 1992). Наиболее часто мутирующим геном-супрессором опухолей является ген р53, мутации которого обнаруживаются приблизительно в 50% всех опухолей.
Без "мишени", общей для всех трансформированных клеток, мечта о "волшебной пуле", которая может разрушить или ревертировать раковые клетки, не повреждая нормальные ткани, остается беспочвенной. Надежда на новое поколение специфически "нацеленных" противоопухолевых препаратов может основываться на возможности идентификации генов-супрессоров опухолей и онкогенов, играющих ключевые роли в контроле клеточного деления.
На сегодня клонированы и охарактеризованы гены-супрессоры, которые определяют чувствительность к следующим видам неоплазий: 1) ретинобластоме (RB1); 2) опухоли Вилмса (WT1); 3) опухоли Ли-Фраумени (TP53); 4) семейному аденоматозному полипозу (APC); 5) нейрофиброматозу типа 1 (NF1); 6) нейрофиброматозу типа 2 (NF2); 7) синдрому фон Хиппель-Линдау (VHL) и 8) множественной эндокринной неоплазии типа 2A (MEN2A).
Локусы генов-супрессоров, которые были генетически картированы, но пока не выделены, включают гены, определяющие развитие следующих заболеваний: множественная эндокринная неоплазия типа 1 (MEN 1); синдром раковых семей Линча типа 2 (LCFS2); семейный рак молочной железы (BRCA1); нейробластома (NB); синдром невуса базальных клеток (BCNS); синдром Беквита-Вайдеманна (BWS); ренальная клеточная карцинома (RCC); бугорчатый склероз (TSC1) и бугорчатый склероз 2 (TSC2).
Охарактеризованные на сегодня гены-супрессоры кодируют продукты, имеющие сходство с белками различных типов, включая ДНК-связывающие белки (WT1), вспомогательные регуляторы транскрипции (RB1), белки, активирующие ГТФазу (GAPs) (NF1), компоненты цитоскелета (NF2), связанные с мембраной рецепторные киназы (MEN2A) и другие продукты, не имеющие явного сходства с известными белками (APC и VHL).
Во многих случаях гены-супрессоры были первоначально идентифицированы благодаря генетическим исследованиям, обнаружившим их утрату или мутацию в некоторых спорадических опухолях.
Это дало основание считать, что области хромосомных аберраций могут указывать на расположение важных генов-супрессоров, задействованных как в предрасположенности к раку, так и в спорадических неоплазиях.
Одной из важных особенностей охарактеризованных на сегодня генов-супрессоров является то, что они с высокой частотой делетированы в опухолях определенных типов. Делеция часто приводит к утрате одного аллеля (так называемая гетерозиготная утрата LOH), но встречается и гомозиготная делеция обоих аллелей. В случае LOH остающийся аллель нефункционален в силу предсуществующей наследуемой мутации или в результате вторичной случайной мутации.
Меланома является широко распространенной опухолью, от которой страдает один американец из ста (Американское противораковое общество, 1992). Факторы окружающей среды, такие как облучение ультрафиолетовым светом, вносят существенный вклад в частоту возникновения этой неоплазии, однако наследственные факторы также играют важную роль. На хромосоме 9р21 был картирован ген семейной меланомы (MLM) (Cannon-Albright et al., 1992; Nancarrow et al., 1993; Gruis et al. , 1993; Goldstein et al., 1994). Наличие единственного предрасполагающего аллеля в локусе MLM увеличивает вероятность возникновения меланомы у данного индивидуума приблизительно в 50 раз. MLM принадлежит к увеличивающемуся семейству генов, подозреваемых в качестве генов-супрессоров опухолей. Предрасположенность к меланоме наследуется как доминантный менделевский признак, хотя предрасполагающие мутации в локусе MLM, по-видимому, действуют как соматические рецессивные аллели, как это впервые предположил Knudson (1971). У индивидуума, предрасположенного к меланоме и несущего один мутантный аллель MLM и один аллель MLM дикого типа, в делящихся клетках происходят вторичные мутации, приводящие к утрате или инактивации копии MLM дикого типа; при этом реализуется наследуемый мутантный аллель MLM.
Наоборот, единственная копия гена дикого типа предотвращает развитие неоплазии.
Хромосомные аберрации в непосредственной близости от MLM в 9р21 локусе были широко охарактеризованы для опухолей нескольких различных типов, включая глиомные клеточные линии, линии немелкоклеточного рака легких и линии острого лимфобластного лейкоза (Olopade et al., 1992; Olopade et al., 1993; Lukeis et al., 1990; Diaz et al., 1988; Middleton et al., 1991; Fountain et al., 1992; Cheng et al., 1993; James et al., 1993).
Таким образом, исходя из частоты хромосомных аномалий в локусе 9р21 в немеланомных опухолевых клетках можно предположить, что область MLM содержит ген (или гены), участвующий по меньшей мере в прогрессии опухолей нескольких различных типов. В этих событиях задействована LOH, а также высокая частота гомозиготных делеций.
Клетки тканей имеют только три возможности своего существования - они могут расти и делиться, не делиться, но оставаться живыми, или же умереть через апоптоз. Опухоли возникают или в результате неприемлемого роста и деления клеток, или же при "отказе" клеток умирать, когда они должны это сделать.
Один из механизмов контроля опухолевого роста должен включать прямую регуляцию клеточного цикла. Например, гены, контролирующие инициацию репликации ДНК, являются возможными кандидатами в онкогены или гены-супрессоры опухолей, в зависимости от стимулирующей или ингибирующей роли в этом процессе. Продвижение эукариотических клеток по циклу (фазы G1, S, G2 и М) регулируется последовательным образованием, активацией и последующей инактивацией ряда циклин/циклинзависимых киназных (Cdk) комплексов. Показано участие в этих процессах циклина D's/Cdk2,4,5, циклина E/Cdk2, циклина A/Cdk2 и циклина B/A/Cdk2. Циклины D's и Cdk2, Cdk4 и Cdk5 участвуют в переходе от G1 к S, то есть на том этапе, когда в клетке "принимается решение" о начале репликации ДНК. Недавно были обнаружены дополнительные элементы контроля клеточного цикла. Это ингибиторы Cdk (Cdk-ингибиторы, CdI), к которым относятся FarI, р21, р40, р20 и р16 (Marx, 1994; Nasmyth & Hunt, 1993).
Недавно было показано прямое участие в регуляции клеточного цикла нескольких онкогенов и генов-супрессоров. Например, один из циклинов (белков, ускоряющих репликацию ДНК) был идентифицирован как онкоген (Motokura et al., 1991; Lammie et al., 1991; Withers et al., 1991; Rosenberg et al., 1991), a опухолевый супрессор Rb взаимодействует с первичными циклинсвязывающими партнерами, Cdks (Ewen et al., 1993). Идентификация локуса чувствительности к меланоме открывает путь для генетического скрининга пациентов в отношении того, например, насколько возрастает риск рака при облучении прямым солнечным светом. MTS может также предрасполагать к большому числу опухолей других локализаций, которые включают (но не ограничиваются указанными) лейкозы, астроцитому, глиобластому, лимфому, глиому, лимфому Ходжкина, множественную миелому, саркому, миосаркому, холангиосаркому, чешуеклеточную карциному, хронический лимфоидный лейкоз (CLL), а также опухоли поджелудочной железы, молочной железы, мозга, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичника, матки, семенников, почки, желудка, ободочной и прямой кишки. Кроме того, поскольку MTS влияет на прогрессию опухолей нескольких различных типов, анализ MTS может быть полезен для определения прогноза для раковых больных. Так, MTS может служить основой для разработки очень важных диагностических тестов, позволяющих определить предрасположенность к таким формам неоплазий, как меланома, окулярная меланома, лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина, множественная миелома, саркома, миосаркома, холангиокарцинома, чешуеклеточная карцинома, хронический лимфоидный лейкоз (CLL), а также опухоли поджелудочной железы, молочной железы, мозга, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичника, матки, семеников, почки, желудка, ободочной и прямой кишки, а также прогнозировать течение ракового заболевания. Кроме того, поскольку MTS участвует в прогрессии опухолей многих типов, можно предложить прямое или непрямое использование способности MTS к супрессии опухолевого роста для общей противоопухолевой терапии. Например, восстановление нормальной функции MTS в опухолевой клетке может превратить ее в неопухолевую.
Настоящее изобретение относится к соматическим мутациям в гене многофункционального опухолевого супрессора (MTS) в злокачественных новообразованиях человека и их использованию для диагностики и прогнозирования рака. Изобретение также относится к мутациям в гене MTS в зародышевой линии и их применению для выявления предрасположенности ко многим типам злокачественных опухолей, таким как меланома, окулярная меланома, лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина, множественная миелома, саркома, миосаркома, холангиокарцинома, чешуеклеточная карцинома, хронический лимфобластный лимфолейкоз (CLL) и опухоли поджелудочной железы, молочной железы, мозга, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичника, матки, семенников, почки, желудка, ободочной и прямой кишки. Кроме того, изобретение относится к терапии злокачественных опухолей человека, для которых характерна мутация в гене MTS, в том числе генной терапии, замещающей белковой терапии и применению белков-миметиков. И наконец, изобретение относится к подбору лекарственных препаратов для лечения рака.
На фиг. 1A показана родословная 3137. Во всех случаях меланомы выявлен чувствительный гаплотип. Кроме того, показаны случаи возникновения других злокачественных новообразований у индивидуумов, имеющих чувствительный гаплотип. Использованы следующие обозначения: закрашенные кружки и квадраты означают меланому; частично закрашенные кружки и квадраты означают другие злокачественные опухоли; / означает смерть больного, * означает, что у индивидуума неизвестна чувствительность гаплотипа; ** означают, что, по-видимому, индивидуум имеет чувствительный гаплотип; возраст исследованных больных обозначен цифрами. Кроме того, указан установленный диагноз.
На фиг. 1B показана родословная 3161. Во всех случаях меланомы выявлен чувствительный гаплотип. Для других злокачественных новообразований чувствительность гаплотипа не определялась. Использованы следующие обозначения: закрашенные кружки и квадраты означают меланому; частично закрашенные кружки и квадраты означают другие злокачественные опухоли; / означает смерть больного; = означает появление болезни в родословной; цифра "3" в пятиугольнике означает несколько браков; цифрами обозначен возраст больного. Кроме того, указан установленный диагноз.
На фиг. 1C показана родословная 3355. Во всех случаях меланомы выявлен чувствительный гаплотип. Для других злокачественных новообразований чувствительность гаплотипа не определялась. Использованы следующие обозначения: закрашенные кружки и квадраты означают меланому; частично закрашенные кружки и квадраты означают другие злокачественные опухоли; / означает смерть больного. Кроме того, указан установленный диагноз.
На фиг. 1D показана родословная 1771 с указанием случаев заболевания меланомой и другими злокачественными опухолями. При изучении этой родословной были идентифицированы мутации в MTS. Использованы следующие обозначения: * означает, что достоверно выявлен носитель мутации; закрашенные кружки и квадраты означают меланому; частично закрашенные кружки и квадраты означают другие злокачественные опухоли (в этой родословной - рак ободочной кишки); / означает смерть больного; цифрами обозначен возраст больного. Кроме того, указан установленный диагноз.
На фиг. 2 показаны YAC (Yeast Artificial Chromosome) и P1-клоны в области, связанной IFNA-s и D9S171. Центромера находится справа. Для P1-клонов стрелки указывают направление к последовательности T7-промотора в векторе. YACs, сгруппированные вместе, соответствуют клонам, которые сходным образом расположены относительно STSs области. Предположительно, эти YACs не идентичны. YACs A5, B11, C6 и F9 содержат IFN-1 и IFN-s. YACs D1, F5 и E3 содержат D9S126 и D9S171. Ни проксимальные концы YACs, содержащие D9S171, ни дистальные концы YACs, содержащие IFNA-s, не показаны. Расстояния приведены не в масштабе. Маркеры, внутренние по отношению к IFNA-s и D9S171, показаны на фиг. 2. Маркеры, которые начинаются с "с", происходят из концевых последовательностей космид. Космиды не показаны. Расстояния между c1b и с5.3 и между 760-L и D9S171 неизвестны.
На фиг. 3 приведена диаграмма делеций, наблюдаемых в меланомных клеточных линиях. Делеции сгруппированы в 12 классов на основе набора маркеров, которые делетированы. Одиннадцать клеточных линий утратили все маркеры, показанные на чертеже. Этот класс не приведен. Количество делеций каждого из 12 других классов указано в колонке, обозначенной "#-линии". Расположение точек разрыва в результате делеций в классах 1-10 показано как приходящееся на маркер, прилегающий к делетированной ДНК; т.е. последний позитивный маркер в серии указывает на делецию. Для классов 11 и 12 сайты делеций обозначены закрашенными треугольниками.
На фиг. 4A показана карта космиды с5. Релевантные STSs, использованные для делеционного анализа, одинаковы для космид и P1-клонов. C1.b-маркер находится проксимально по отношению к Р1-1062 и не показан. Транскрипционные ориентации MTS1 и MTS2 отмечены стрелками.
На фиг. 4B показана карта рестрикции и STS-карта космиды с5. Положения кодирующих экзонов для MTS1 и MTS2 отмечены черными прямоугольниками. E1 и E2 обозначают кодирующий экзон 1 и кодирующий экзон 2. "В" обозначает BamHI, "S" - SalI, "R" - EcoRI и "R5" - EcoRV.
На фиг. 5A и 5B сравниваются геномная последовательность MTS1, содержащая 5'-нетранслируемую область, экзон 1 и часть интрона 1, и опубликованная последовательность p16 (Serrano et al. , 1993). Стартовый кодон (подчеркнут черной линией) находится в положении 891, а участок сплайсинга (отмечен стрелкой) находится в положении 1016. Последовательность MTS1, показанная на фиг. 5A-B, представляет собой последовательность SEQ ID NO: 3. Последовательность р16, показанная на фиг. 5B, представляет собой последовательность SEQ ID NO: 24.
На фиг. 6A и 6B сравниваются геномная последовательность MTS1, содержащая экзон 2 и часть интрона 2, и опубликованная последовательность р16 (Serrano et al., 1993). Участки сплайсинга (отмечены стрелками) расположены до положения 192 и после положения 498. Последовательность MTS1, показанная на фиг. 6A-B, представляет собой последовательность SEQ ID NO: 4. Последовательность р16, показанная на фиг. 6A, идентична последовательности нуклеотидов 192-498 SEQ ID NO: 4.
На фиг. 7A и 7B сравнивается геномная последовательность MTS2, содержащая часть интрона 1, "экзон 2" и промежуточные участки, и опубликованная последовательность р16. Последовательность "экзона 2" сходна с экзоном 2 MTS1 от нуклеотида 273 до 580. Сайт сплайсинга в MTS2 и р16 отмечены стрелками. Точка, в которой начинается расхождение, обозначена "o". Кодон терминации MTS2 расположен в экзоне 2 в положении 532 и обозначен "*". Последовательность MTS2, показанная на фиг. 7B, представляет собой последовательность SEQ ID NO: 5. Последовательность р16, показанная на фиг. 7А, идентична последовательности нуклеотидов 192-498 SEQ ID NO: 4.
На фиг. 8 сравниваются последовательности ДНК MTS1 и MTS2, включающие экзон 2 и часть каждого окружающего интрона. Положения 3'-сплайсингового соединения интрона 1 и 5'-сплайсингового соединения интрона 2 в MTS1 обозначены треугольниками. Точка расхождения около 3'-конца кодирующего экзона 2 отмечена стрелкой. Приведенная последовательность MTSI соответствует последовательности нуклеотидов 92-548 SEQ ID NO: 4. Приведенная последовательность MTS2 соответствует последовательности нуклеотидов 174-630 SEQ ID NO: 5.
На фиг. 9 показаны делеции различных STS в опухолевых клеточных линиях. В каждую ПЦР включали позитивные и негативные контроли. Клеточные линии, в которых были делетированы только одна или две STS (например, класс 21) повторно тестировали по крайней мере дважды.
На фиг. 10А-10С показана экспрессия мРНК MTS2. На фиг. 10А отражен относительный уровень транскриптов MTS2 мРНК (Clonetech), полученной из различных тканей человека. Линия 1 - мозг; линия 2 - молочная железа; линия 3 - почки; линия 4 - легкие; линия 5 - лимфоциты; линия 6 - яичники; линия 7 - поджелудочная железа; линия 8 - предстательная железа; линия 9 - селезенка; линия 10 - желудок; линия 11 - тимус. Происхождение продуктов с иной, чем ожидаемая, молекулярной массой (см. линию 1) неизвестно.
На фиг. 10В отражен относительный уровень транскриптов MTS2 в лимфоцитах человека как функция времени после митогенной индукции. Линия 1 - 0 часов; линия 2 - 1 час; линия 3 - 2 часа; линия 4 - 4 часа; линия 5 - 8 часов; линия 6 - 16 часов; линия 7 - 24 часа; линия 8 - 32 часа; линия 9 - 40 часов; линия 10 - 48 часов; линия 11 - 56 часов; линия 12 - 64 часа. Большая часть клеток находится в S-фазе (40-50 часов после индукции).
На фиг. 10С отражен уровень транскриптов MTS2 как функция Rb-статуса. Rb-позитивными клеточными линиями являются следующие: полоса 1 - KIT (Hori et al. , 1987); полоса 2 - диплоидные фибробласты человека MRC5, пассаж 28; полоса 3 - VWSCC2; полоса 4 - Bris-tol 8; полоса 7 - T24. RB-негативными клеточными линиями являются следующие: полоса 8 - MDA MB 468; полоса 9 - 5637; полоса 10 - С33А; полоса 11 - SiHa; полоса 12 - CaSki; полоса 13 - WERI.
На фиг. 11 показана последовательность кДНК (и соотвествующего полипептида) для 5'-нетранслируемого участка MTS2. Начало экзона 2 находится в положении 491 и отмечено стрелкой. Приведенная последовательность соответстует последовательности SEQ ID NO: 15, а аминокислотная последовательность - последовательности SEQ ID NO: 16.
На фиг. 12А и 12В показана последовательность кДНК (и соотвествующего полипептида) MTS1E1-бета. Сайты сплайсинга отмечены стрелками. Начало экзона 2 находится в положении 335, а экзон начинается в положении 642. Приведенная последовательность соответствует последовательности SEQ ID NO: 13, a аминокислотная последовательность - последовательности SEQ ID NO: 14.
На фиг. 13 приведена физическая карта области р16. Положения экзона 1-альфа (E1-альфа), экзона 1-бета (E1-бета), экзона 2 (E2) и экзона 3 (E3) отмечены закрашенными прямоугольниками. Отмечена локализация сайтов рестрикции EcoRI (R1), EcoRV (RV) и SalI (S). Выше рестрикционной карты показаны геномные космидные клоны с5 и P1 1063. Ниже рестрикционной карты показаны делеции в клеточных линиях А375 и SK-mel 93. Пунктирная линия соответствует делетированной ДНК.
На фиг. 14 показаны совпадения между последовательностями транскриптов р16-бета человека и мыши. Заглавными буквами обозначены идентичные нуклеотиды. Стоп-кодоны в рамке считывания р16 подчеркнуты. Сплайсинговое соединение между E1-бета и E2 отмечено знаком V. Приведенная бета-последовательность мыши соответствует последовательности SEQ ID NO: 25. Приведенная бета-последовательность человека соответствует последовательности нуклеотидов 193-461 SEQ ID NO: 13.
На фиг. 15 показана экспрессия альфа-транскрипта в клеточных линиях, которые содержат делеции E1-бета. кДНК получают при использовании тотальной РНК, выделенной из указанных образцов. В реакциях амплификации Р16-транскриптов использовали радиоактивно-меченый праймер. Смешивали эквивалентные объемы для амплификации альфа и бета и разделяли продукты в денатурирующем 5%-ном полиакриламидном геле: полоса 1 - T-клетки в состоянии покоя; полоса 2 - клеточная линия SK-mel 93; полоса 3 - клеточная линия А375.
На фиг. 16 A-16D показана экспрессия транскриптов Р16. В реакциях амплификации Р16-транскриптов использовали радиоактивно-меченый праймер и продукты разделяли в денатурирующем 5%-ном полиакриламидном геле.
Фиг. 16А и 16D иллюсстрируют эксперимент, в котором до проведения гель-электрофореза реакционные смеси амльфа и бета из одного образца смешивали между собой. На фиг. 16А показан относительный уровень Р16-транскриптов во фракции РНК, полученной из различных тканей и клеток человека. Полоса 1 - мозг; полоса 2 - молочная железа; полоса 3 - почки; полоса 4 - легкие; полоса 5 - лимфоциты; полоса 6 - яичники; полоса 7 - поджелудочная железа; полоса 8 - предстательная железа; полоса 9 - селезенка; полоса 10 - желудок; полоса 11 - тимус. На фиг. 16В показано относительное количество бета-транскрипта в лимфоцитах человека как функции времени после митогенной индукции: полоса 1 - 0 часов; полоса 2 - 1 час; полоса 3 - 2 часа; полоса 4 - 4 часа; полоса 5 - 8 часов; полоса 6 - 16 часов; полоса 7 - 24 часа; полоса 8 - 32 часа; полоса 9 - 40 часов; полоса 10 - 48 часов; полоса 11 - 56 часов; полоса 12 - 64 часа.
На фиг. 16С показано относительное количество альфа-транскрипта в лимфоцитах человека как функции времени после митогенной индукции: полосы означают то же, что и на фиг. 16В, однако временная точка, соответствующая 1 часу, опущена. Анализировалась также экспрессия других молекул, для которых предполагается их влияние на ход клеточного цикла и образование которых регулируется на транскрипционном уровне во время клеточного цикла. В соответствии с предварительными результатами уровни CDK4 GoS2 (молекулы неизвестной функции, но транскрипция которых индуцируется при вхождении покоящихся T-клеток в клеточный цикл) возрастали при индукции T-клеток (Russell and Forsdyke, 1991; Matsushime et al., 1992; Geng and Weinberg, 1993). В противоположность этому уровни РНК р27, по-видимому, не изменялись во время осуществления эксперимента (Tiyshima and Hunter, 1994; Kota et al., 1994).
На фиг. 16В показан уровень транскриптов Р16 как функции Rb-статуса. Rb-негативные клеточные линии: полоса 1 - WERI; полоса 2 - CaSki; полоса 3 - SiHa; полоса 4 - С334; полоса 5 - 5637; полоса 6 - MDA MB 468. Rb-положительные клеточные линии: полоса 12 - диплоидные фибробласты человека MRC5, пассаж 28; полоса 13 - KIT (Hori et al., 1987).
На фиг. 17 показана последовательность кДНК MTS1, включая некодирующие участки кДНК. Треугольниками обозначены сплайсинговые соединения. Разбивка в последовательности второго сплайсингового соединения только выделяет его и не означает пропущенных оснований. Приведенная последовательность соответствует последовательности SEQ ID NO: 36.
Настоящее изобретение относится к соматическим мутациям гена многофункционального супрессора опухолей (MTS) при раковых заболеваниях человека и использованию этих мутаций для диагностики и прогнозирования раковых заболеваний. Изобретение также относится к зародышевым мутациям гена MTS и к их использованию для диагностики предрасположенности к различным формам рака, таким как меланома, окулярная меланома, лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина, множественная миелома, саркома, миосаркома, холангиокарцинома, чешуеклеточная карцинома легких, хронический лимфоидный лимфолейкоз (CLL), а также опухоли поджелудочной железы, молочной железы, мозга, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичника, матки, семенников, почек, желудка, ободочной и прямой кишки. Изобретение относится к терапии злокачественных опухолей человека, для которых характерна мутация в гене MTS, в том числе генной терапии, замещающей белковой терапии и применению миметических белков. И наконец, изобретение относится к подбору лекарственных препаратов для лечения рака.
В настоящем изобретении заявлены выделенные полинуклеотиды, представляющие целый локус MTS или его часть или мутированный локус MTS, протяженностью не менее восьми оснований и не более 100 тысяч оснований. Подобные полинуклеотиды могут быть антисмысловыми полинуклеотидами. В настоящем изобретении заявлена также рекомбинантная конструкция, содержащая подобный полинуклеотид, например рекомбинантная конструкция, применимая для экспрессии в трансформированных клетках.
Кроме того, в настоящем изобретении заявлены методы обнаружения полинуклеотида, представляющего часть локуса MTS, или продукт его экспрессии. Подобный метод может включать этап амплификации части локуса MTS, а также этап создания набора полинуклеотидов, являющихся праймерами для амплификации указанной части локуса MTS. Метод применим как для диагностики предрасположенности к раку, так и для диагностики и прогнозирования рака. В настоящем изобретении заявлены также антитела, предпочтительно моноклональные антитела, которые специфически связываются с выделенным полипептидом, представляющим по меньшей мере пять аминокислотных остатков, кодируемых локусом MTS.
В настоящем изобретении заявлены наборы для обнаружения в пробах полинуклеотидов, представляющих часть локуса MTS. Эти наборы представляют собой полинуклеотиды, комплементарные части локуса MTS, упакованные в подходящий контейнер и снабженные инструкцией по применению.
В настоящем изобретении заявлены также методы получения полинуклеотидов, представляющих собой полимеризующиеся полинуклеотиды, которые образуют последовательность, состоящую по меньшей мере из восьми последовательных нуклеотидов локуса MTS; методы получения полипептида, представляющего собой полимеризующиеся аминокислоты, которые образуют последовательность, состоящую по меньшей мере из пяти аминокислот, кодируемых локусом MTS.
Кроме того, в настоящем изобретении заявлены методы скрининга лекарств для терапии опухолей с целью идентификации препаратов для восстановления функции продукта гена MTS.
Наконец, в настоящем изобретении изложена стратегия создания генных терапевтических подходов, направленных на раковые клетки. Подобные терапевтические агенты могут иметь вид полинуклеотидов, представляющих часть или полный локус MTS, помещенных в соответствующие векторы или доставленные в клетку-мишень другими, более прямыми методами, с целью восстановления функции белка MTS. Терапевтические агенты могут иметь также вид полипептидов, основанных на частичной или полной белковой последовательности MTS. Они могли бы функционально замещать активность MTS in vivo.
Открытием настоящего изобретения является тот факт, что локус MTS (ранее обозначавшийся как меланомный локус, MLM), который предрасполагает индивидуума к меланоме и другим видам рака, является геном MTS1, который является ингибитором Cdk, в частности Cdk4. Этот ген обозначен MTS1. Открытием настоящего изобретения является еще и тот факт, что локус MTS содержит вторую кодирующую последовательность, MTS2, которая весьма сходна с MTS1 в части последовательностей. Установлено также, что ген MTS1 имеет два отдельных промотора - альфа и бета. При использовании промотора альфа РНК состоит из экзона 1-альфа, экзона 2 и экзона 3. Она обозначена как MTS1. При использовании промотора бета образующаяся РНК состоит из экзона 1-бета, экзона 2 и экзона 3. Она обозначена как MTS1E1-бета. Открытием настоящего изобретения является тот факт, что мутации локуса MTS в зародышевой линии являются показателями для предрасположенности к меланоме и другим видам рака. Наконец, показано, что соматические мутации в локусе MTS ассоциированы с большинством, если не со всеми, видами опухолей и, таким образом, являются общим индикатором рака и могут служить для прогнозирования рака. Мутационные события в локусе MTS могут включать делеции, инсерции и точечные мутации как в кодирующих, так и в некодирующих последовательностях.
Локус MLM был впервые генетически картирован при выявлении драматической связи между генетическими маркерами и предрасположенностью к меланоме в нескольких родословных в Юте и одной родословной в Техасе (Cannon-Albright, 1992). Область, определенная по рекомбинантам в родословных, фланкирована маркерами D9S736 и D9S171. Впоследствии эти и другие генетические маркеры были использованы для локализации гена путем анализа гомозиготных делеций в меланомных и немеланомных опухолевых клеточных линиях, содержащих делеции. Минимальная область перекрывания делеций была фланкирована маркерами IFNA-s и D9S171. Библиотеки YAC (Yeast atrificial chromosomes - искусственная хромосома дрожжей) были проскринированы с целью идентификации геномных клонов, окружающих эти маркеры. Клоны P1, выделенные в результате "прогулки про хромосоме", оказались непрерывными от IFNA-s до D9S171 за исключением двух пробелов.
Специфические STS (site-tagged sequences) получали для конструирования более подробной молекулярной карты. С использованием этих маркеров, а также делеционного анализа, область перекрывания делеций была определена возле
маркеров с5.1 и c5.3, обнаруженных в космиде с5. Наиболее часто делетированным оказался маркер c5.3, наиболее близкий к MTS.
Анализ маркера с5 на наличие "CpG"-островков показал, что он содержит по меньшей мере один "ген-кандидат" в MTS. Были определены последовательности ДНК EcoRI-фрагментов с5, которые сравнили с последовательностями из генного банка. Две различные области с5 оказались сходными с ранее идентифицированным геном, кодирующим ингибитор Cdk4 человека, или р16 (Serrano et al., 1993). Эти два гена-кандидата были обозначены как MTS1 и MTS2. Скрининг кДНКовых библиотек из лимфоцитов, эмбрионального мозга и нормальной молочной железы при помощи пробы из экзона 2 MTS1 привел к обнаружению дополнительного кандидата, названного MTS1E1-бета.
Подробное сравнение геномных последовательностей с5 с последовательностью мРНК р16 показало, что MTS1 содержит фрагмент в 307 пар нуклеотидов, идентичный части кодирующей последовательности р16. Этот фрагмент MTS1 был фланкирован узнаваемыми последовательностями сплайсинговых соединений. Дальнейшие исследования MTS1 показали, что он включает полную кодирующую последовательность р16 и еще два интрона. Интрон 1 был локализован на 126 пар оснований "ниже" сайта начала трансляции; интрон 2 был локализован на 11 пар оснований "выше" сайта окончания трансляции. Два интрона разделяют кодирующие последовательности р16 на три области, 5'-область в 126 пар оснований (кодирующий Экзон 1), среднюю область в 307 пар оснований (кодирующий Экзон 2) и 3'-область в 11 пар оснований (кодирующий Экзон 3).
MTS2 содержал область последовательностей ДНК, почти идентичную р16 в той части, которая простирается от 5'-конца кодирующего экзона 2 приблизительно на 200 пар нуклеотидов по направлению к интрону 2. Однако сходство последовательностей уменьшалось к точке 51 пара нуклеотидов "выше" интрона 2 MTS1, в которой две последовательности дивергировали полностью. Это положение соответствует локализации последнего кодона MTS2. Сравнение последовательностей MTS1 и MTS2 показало, что сходство последовательностей этих двух генов также простирается на 50 пар нуклеотидов "выше" 3'-сплайсингового соединения интрона 1. Таким образом, фрагменты некодирующей ДНК оказались более консервативными, чем некоторые области предположительно кодирующей ДНК. Чтобы исключить возможность того, что дивергенция последовательностей является артефактом клонирования, были сконструированы ПЦР-праймеры для специфической амплификации последовательности в точке дивергенции MTS2. Эти праймеры амплифицировали фрагмент предсказанного размера из космиды P1 и геномной ДНК. Таким образом, дивергированная последовательность, расположенная "ниже" 3'-конца экзона 2 MTS2, является bona fide геномной последовательностью.
MTS1E1-бета содержит экзон 1, названный экзон 1-бета или E1-бета, который имеет последовательность, отличную от обнаруживаемой в экзоне 1 MTS1 и MTS2. MTS1E1-бета также содержит экзон 2 (E2) и экзон 3 (E3), которые идентичны экзонам 2 и 3 MTS1. Экзон 1-бета локализован "выше" экзона 1 MTS1 и не содержит какой-либо кодирующей последовательности. В результате MTS1E1-бета кодирует р10, для которого началом трансляции служит первый ATG-кодон экзона 2.
MTS1 и MTS2 исследовали на соответствие с генетической чувствительностью локуса MTS путем анализа геномной ДНК индивидуумов, предположительно несущих предрасполагающие MLM-аллели. Полиморфизмы ДНК были обнаружены в экзоне 2 MTS1 одного из восьми индивидуумов. Мутация представляла собой замену одного нуклеотида, что приводило к замене аминокислоты. Этот полиморфизм сегрегировал вместе в предрасполагающим MLM-аллелем.
Преобладание повреждений в MTS1 (делеции и замены нуклеотидов) указывает на то, что MTS1 или другой близко расположенный локус участвуют в формировании опухолевого фенотипа.
Клетки, имеющие подобные повреждения, получают селективное преимущество перед теми клетками, которые не имеют таковых.
Альтернативное объяснение, состоящее в том, что указанные повреждения являются случайными и не имеют отношения к росту клеток, представляется неубедительным по ряду причин. Во-первых, высокая корреляция между опухолевым фенотипом и мутациями MTS1 указывает на причинно-следственные отношения между мутациями MTS1 и образованием опухолей. Во-вторых, MTS1 определяет чувствительность к меланоме и потому действует независимо как ген-супрессор опухолей. В-третьих, биохимическая роль р16 как мощного ингибитора Cdk хорошо согласуется с моделью, согласно которой MTS1 действует in vivo как общий ингибитор начала репликации ДНК.
В соответствии с диагностическими и прогностическими методами настоящего изобретения, обнаружены изменения в локусе MTS дикого типа. Кроме того, может быть использован метод для обнаружения локуса MTS дикого типа и подтверждения отсутствия предрасположенности к неоплазии и самой неоплазии. Термин "изменения гена дикого типа" подразумевает все формы мутаций, включая делеции, инсерции и точечные мутации в кодирующих и некодирующих областях. Делеции могут затрагивать ген целиком или его части. Точечные мутации могут приводить к образованию стоп-кодонов, сдвигам рамки считывания и замене аминокислот. К соматическим мутациям относятся те, которые обнаруживаются в какой-либо из тканей организма, например в опухолевой ткани, и не наследуются в зародышевой линии. Мутации в зародышевой линии могут быть обнаружены в любой ткани организма и наследуемы. Если соматически мутирован только один аллель, это указывает на раннее неопластическое состояние. Мутация обоих аллелей служит указанием на позднее неопластическое состояние. Таким образом, обнаружение мутаций MTS дает как диагностическую, так и прогностическую информацию. Неделетированный аллель MTS (т.е. обнаруживаемый на хромосоме, сестринской по отношению к хромосоме, несущей делецию MTS) может быть исследован в отношении других мутаций, таких как инсерции, малые делеции и точечные мутации. Считается, что многие мутации, обнаруживаемые в опухолевой ткани, приводят к снижению экспрессии продукта гена MTS. Однако мутации, приводящие к образованию нефункционального продукта, также могут приводить к неопластическому состоянию. Точечные мутационные события могут происходить в регуляторных областях, таких как промотор гена, что может приводить к утрате или снижению экспрессии мРНК. Точечные мутации могут также нарушить нормальный процессинг РНК, что скажется на экспрессии продукта гена MTS, может снизить эффективность трансляции и стабильность мРНК. Полезные диагностические методы включают (но не ограничиваются) флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), прямое секвенирование ДНК, анализ PFGE, блот-гибридизацию по Саузерну, "одноцепочечный" конформационный анализ, тест защиты от РНКазы, аллельспецифические олигонуклеотиды (ASO), дот-блот-гибридизацию и PCR-SSCP, которые более подробно изложены ниже.
Предрасположенность к меланоме и другим описанным в данной заявке формам рака может быть подтверждена исследованием любой ткани человека в отношении мутаций гена MTS. Например, человек, который унаследовал мутацию гена MTS в зародышевой линии, может быть подвержен раковым заболеваниям. Этот факт может быть установлен путем анализа любой ткани организма. Наиболее простой способ - взятие крови с последующим выделением ДНК из клеток крови. Кроме того, может быть проведена пренатальная диагностика путем анализа на мутации гена MTS клеток плода, плацентарных клеток или клеток амниотической жидкости. Изменения аллеля MTS дикого типа, например, точечной мутацией или делецией, может быть обнаружено любым из описанных здесь методов.
Для обнаружения изменений в гене MTS дикого типа из ткани необходимо выделить образец, свободный от окружающей нормальной ткани. Методы обогащения опухолевых клеток, выделенных из тканевых препаратов, хорошо известны. Например, образец ткани может быть взят из парафиновых или криостатных срезов. Раковые клетки могут быть отделены от нормальных проточной цитометрией. Эти методы и другие подходы к разделению опухолевых и нормальных клеток хорошо известны. Если опухолевая ткань в значительной степени контаминирована нормальными клетками, обнаружение мутаций затруднено.
Быстрый предварительный тест на полиморфизмы последовательностей ДНК может быть проведен при анализе набора Саузерн-блотов ДНК, рестрицированной одной или несколькими эндонуклеазами, предпочтительно многими эндонуклеазами. На каждом блоте должны быть представлены образцы от нормальных индивидуумов и образцы, взятые от раковых больных. Блоты, содержащие гибридизующиеся фрагменты, отличающиеся по длине от контрольных (при гибридизации с пробой, представляющей локус MTS), указывают на возможную мутацию. При использовании крупнощепящих рестриктаз, дающих очень большие рестрикционные фрагменты, используют пульс-электрофорез ("PFGE").
Обнаружение точечных мутаций может быть дополнено молекулярным клонированием аллеля (аллелей) MTS с применением хорошо известных методов. Альтернативно, последовательности гена могут быть амплифицированы "впрямую" из геномной ДНК, выделенной из опухолевой ткани. Затем может быть определена последовательность нуклеотидов амплифицированной ДНК.
Имеется шесть хорошо известных методов более сложного, но непрямого подтверждения присутствия чувствительного аллеля: 1) одноцепочечный конформационный анализ ("SSCA") (Orita et al, 1989); 2) электрофорез в денатурирующем градиентном геле ("DGGE") (Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989); 3) тест защиты от РНКазы (Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991); 4) аллельспецифические олигонуклеотиды ("ASOs") (Conner et al., 1983); 5) использование белков, узнающих нуклеотидные несовпадения, таких как mutS-белок E.coli (Modrich, 1991); и 6) аллельспецифическая полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Rano & Kidd, 1989). Для аллельспецифической ПЦР используют праймеры, гибридизующиеся своим 3'-концом с точкой отдельной мутации MTS. Если этой отдельной мутации нет, то отсутствует продукт амплификации. Кроме того, может быть также использована амплификационная система рефракторных мутаций (Amplification Refractory Mutation System, ARMS), как это описано в публикации европейской патентной заявки N 0332435 и Newton et al., 1989. Инсерции и делеции генов могут быть также обнаружены при помощи клонирования, секвенирования и амплификации. Кроме того, для обнаружения повреждений аллеля или инсерций в полиморфный фрагмент могут быть применены пробы полиформизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP), специфичные относительно данного гена или окружающих маркерных генов. Этот метод особенно полезен при скрининге родственников больного на наличие мутаций MTS, обнаруживаемых у данного больного. Могут быть использованы другие известные методы обнаружения инсерций и делеций.
В случае применения первых трех методов (т.е. SSCA, DGGE и теста на защиту от РНКазы) появляется новая электрофоретическая полоса. SSCA обнаруживает полосу, которая мигрирует иначе, поскольку изменения в последовательности обусловливают изменения во внутримолекулярных соединениях оснований одноцепочечной ДНК. В ходе анализа методом защиты от РНКазы происходит разрезание мутантного полинуклеотида на два или более двух меньших по размерам фрагмента. DGGE показывает различия в скорости миграции мутантных последовательностей по сравнению с последовательностями дикого типа в денатурирующем градиентном геле. При использовании аллельспецифического нуклеотида конструируется олигонуклеотид, способный распознавать специфическую последовательность, а вывод о результатах анализа делается по наличию или отсутствию сигнала гибридизации.
В случае mutS-теста белок связывается только с последовательностью, которая имеет нуклеотидные несовпадения в гетеродуплексе между мутантными последовательностями и последовательностями дикого типа.
В настоящей заявке под "несовпадениями" подразумеваются сгибридизованные нуклеиновые дуплексы, в которых обе цепи комплементарны не на 100%. Отсутствие полной гомологии может быть обусловлено делециями, инсерциями, инверсиями или заменами. Обнаружение несовпадений может быть использовано для выявления точечных мутаций в гене или в его мРНК. Поскольку эти методы менее чувствительны, нежели секвенирование, их проще осуществлять с большим числом образцов опухолевого материала. Примером метода "разрезания несовпадений" служит метод защиты от РНКазы. В контексте настоящего изобретения данный метод подразумевает использование меченой рибопробы, которая комплементарна кодирующей последовательности гена MTS дикого типа человека. Рибопробу и мРНК или ДНК, выделенные из опухолевой ткани, "отжигают" (гибридизуют) вместе и затем переваривают ферментом РНКазой А, способной обнаруживать некоторые несовпадения в дуплексной структуре РНК. Если РНКаза А обнаруживает несовпадение, она производит разрезание в этом месте. Таким образом, при разделении электрофорезом сгибридизованного препарата РНК в случае обнаружения несовпадения и разрезания РНКазой А, будет обнаружен продукт с длиной, меньшей, чем длина полного дуплекса РНК для рибопробы и мРНК или ДНК. Рибопроба не обязательно должна иметь полную длину мРНК MTS или представлять весь ген. Если рибопроба представляет только сегмент мРНК или гена, желательно использовать набор таких проб для скринирования на несовпадения всей последовательности мРНК.
Сходным образом могут быть применены ДНК-пробы для обнаружения несовпадений с использованием энзиматического или химического разрезания. Например, см. Cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986. Альтернативно, несовпадения могут быть обнаружены по сдвигу электрофоретической подвижности "несовпадающих" дуплексов по сравнению с "совпадающими" дуплексами. Например, см. Cariello, 1988. Как в случае применения рибопроб, так и в случае применения ДНК-проб, клеточные мРНК или ДНК, в которых подозревают наличие мутаций, могут быть амплифицированы ПЦР (см. ниже) перед гибридизацией. Изменения в ДНК гена MTS могут быть также обнаружены гибридизацией по Саузерну, особенно если эти изменения представляют собой большие перестройки, такие как делеции и инсерции.
Последовательности ДНК гена MTS, амплифицированные с помощью ПЦР, могут быть скринированы с применением аллельспецифических проб. Эти пробы представляют собой нуклеиновые олигомеры, каждый из которых содержит область гена MTS, несущую известную мутацию. Например, один из олигомеров может иметь 30 нуклеотидов в длину и соответствовать части последовательности MTS-гена. При использовании набора таких аллельспецифических проб продукты ПЦР можно скринировать на наличие ранее идентифицированных мутаций MTS-гена. Можно провести гибридизацию аллельспецифических проб с амплифицированными последовательностями MTS, например на нейлоновых фильтрах. Гибридизация с определенной пробой в жестких условиях указывает на наличие в опухолевой ткани той же мутации, что и в аллельспецифической пробе.
Наиболее определенным тестом на наличие мутаций в подозрительном локусе является прямое сравнение геномных последовательностей MTS от раковых больных с аналогичными образцами из контрольной популяции. Наоборот, секвенирование мРНК после амплификации, например с помощью ПЦР, может исключить необходимость определять экзонную структуру гена-кандидата.
При исследовании некодирующих областей, таких как интроны, регуляторные последовательности, расположенные около или внутри гена MTS, у раковых больных могут быть обнаружены мутации, находящиеся вне кодирующей области MTS. Указания на то, что мутации в некодирующих областях могут оказаться важными, следуют из экспериментов с применением Нозерн-блоттинга, в которых у раковых больных обнаружены молекулы РНК аномального размера или избыточности, не встречающиеся у контрольных индивидуумов.
Нарушения экспрессии мРНК MTS может быть обнаружено любым известным методом. Эти методы включают Нозерн-блоттинг, амплификацию ПЦР и тест защиты от РНКазы. Сниженная экспрессия мРНК указывает на нарушения гена MTS дикого типа. Изменения генов MTS дикого типа можно обнаружить посредством тестирования нарушений в белке MTS дикого типа. Например, могут быть использованы моноклональные антитела, иммунореактивные по отношению к белку MTS. Отсутствие распознавания антигена указывает на мутацию MTS. Антитела, специфичные относительно продуктов мутантных аллелей, могут быть использованы для обнаружения продуктов мутантного MTS-гена. Указанные иммунологические тесты могут быть осуществлены любым приемлемым методом.
Эти методы включают Вестерн-блот, иммуногистохимические методы и ELISA. Любые подходы для обнаружения измененного белка MTS уместны для поиска изменений генов MTS дикого типа. Могут быть использованы такие функциональные подходы, как определение связывания белка. Например, известно, что белок MTS связывается с Cdk, в частности с Cdk4. Таким образом, можно использовать способность связываться с белком MTS дикого типа или с Cdk4. Кроме того, можно использовать тесты, основанные на биохимических свойствах MTS, на его способности ингибировать Cdk, такие как Cdk4, и влияние MTS на клеточный цикл. Обнаружение мутантного продукта гена MTS указывает на изменения MTS-гена дикого типа.
Мутантные гены MTS или продукты этого гена могут быть обнаружены в других биологических образцах, взятых у пациента, а именно в сыворотке, кале, моче и мокроте. Те же описанные выше методы обнаружения мутантных генов MTS или их продуктов в тканях могут быть применены в случае других биологических образцов. Раковые клетки слущиваются с опухоли и обнаруживаются в указанных биологических образцах. Кроме того, продукт гена MTS может секретироваться в межклеточное пространство и обнаруживаться в указанных биологических образцах даже в отсутствие раковых клеток. При скринировании указанных биологических образцов возможна простая и быстрая постановка диагноза при многих формах рака. Кроме того, по результатам анализа подобных биологических образцов на мутантные гены MTS или их продукты можно судить о результативности химио- и радиотерапии.
Описанные в настоящей заявке методы диагностики применимы к любым случаям неоплазий, для которых показано участие MTS в туморогенезе. Делеции хромосомного плеча 9р или соматические мутации в области MTS наблюдались почти во всех исследованных опухолях. Представленный в настоящем изобретении метод диагностики полезен для клиницистов и позволяет им выбрать соответствующий курс лечения.
Описанные в настоящем изобретении пары праймеров применимы для определения нуклеотидной последовательности конкретного аллеля MTS с помощью ПЦР. Пары одноцепочечных ДНК-праймеров могут быть сгибридизованы с последовательностями MTS-гена или последовательностями, окружающими его на хромосоме 9, для амплифицирующего синтеза собственно MTS-гена. Полный набор этих праймеров позволяет синтезировать все нуклеотиды кодирующих последовательностей MTS-гена, т. е. экзонов. Данный набор праймеров позволяет синтезировать как интронные, так и экзонные последовательности. Могут быть использованы и аллельспецифические праймеры. Такие праймеры гибридизуются только с конкретными мутантными аллелями MTS и, таким образом, амплификация происходит только в том случае, если в качестве матрицы присутствует мутантный аллель.
Для облегчения последующего клонирования амплифицированных последовательностей праймеры могут нести на своих 5'-концах сайты рестрикции. Таким образом, все нуклеотиды праймеров являются производными от последовательностей MTS или прилегающих к этому гену последовательностей, за исключением нескольких нуклеотидов, необходимых для формирования сайтов рестрикции. Ферменты рестрикции и сайты их узнавания на ДНК широко известны. Сами праймеры могут быть синтезированы с помощью стандартных методов. Вообще, праймеры могут быть синтезированы с применением олигонуклеотидных синтезаторов, коммерчески доступных приборов. Последовательности скрытых рамок считывания MTS приведены в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 15 и SEQ ID NO: 36, конструкция конкретных праймеров вполне очевидна.
Описанные в настоящем изобретении нуклеотидные пробы могут иметь ряд применений. Их можно применять в гибридизации по Саузерну с геномной ДНК и в методе защиты от РНКазы для обнаружения точечных мутаций, как это обсуждалось выше. Эти пробы могут быть использованы для обнаружения продуктов амплификации ПЦР. Они также применимы для обнаружения несовпадений с геном MTS или с мРНК посредством других методов.
При описании настоящего изобретения использованы следующие определения.
"Амплификация полинуклеотидов" подразумевает применение таких методов, как полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR), лигазная амплификация (или лигазная цепная реакция, ЛЦР, LCR), а также методы амплификации, основанные на использовании Q-бета репликазы. Эти методы хорошо известны и широко применяются на практике. Например, см. патенты США 4683195 и 4683202, а также Innis et al., 1990 (ПЦР) и Wu et al., 1989а (ЛЦР). Реагенты и оборудование для проведения ПЦР коммерчески доступны. Праймеры, используемые для амплификации последовательностей MTS-области, предпочтительно комплементарны и, соответственно, специфически гибридизуются с последовательностями MTS-области или же с последовательностями, которые фланкируют MTS-область. Последовательности MTS, полученные в результате амплификации, могут быть непосредственным образом секвенированы. Менее предпочтительно, чтобы амплифицированные последовательности были клонированы перед секвенированием. Метод прямого клонирования и секвенирования энзиматически амплифицированных геномных фрагментов описан Scharf, 1986.
"Анализируемый полинуклеотид" и "Анализируемая цепь" обозначают одно- или двуцепочечный полинуклеотид, в котором ожидается наличие искомой последовательности и который может быть представлен в образцах различных типов, включая биологические образцы.
"Антитела". В настоящем изобретении описаны поликлональные и/или моноклональные антитела, или фрагменты таковых, или их эквиваленты в отношении иммунологического связывания, которые способны специфически взаимодействовать с полипептидами MTS, фрагментами таких полипептидов, или с полинуклеотидными последовательностями MTS-области, особенно из MTS-локуса, или же с фрагментами таких нуклеотидных последовательностей. Термин "антитело" применяется для обозначения как гомогенного вещества, так и для смеси, подобной сыворотке и содержащей множество различных гомогенных веществ. Полипептиды могут быть получены синтетическим путем с помощью пептидного синтезатора, конъюгированы с молекулами носителя (например, гемоцианином моллюска фиссуреллы) и в течение нескольких месяцев вводиться кроликам. Сыворотки кроликов проверяют на иммунореактивность по отношению к полипептиду MTS или его фрагментам. Моноклональные антитела могут быть получены иммунизацией мышей природными полипептидами, слитыми белками или фрагментами тех или других. Моноклональные антитела могут быть отобраны методом ELISA и проверены на специфическую иммунореактивность с полипептидом MTS или его фрагментами (см. Harlow & Lane, 1988). Данные антитела могут быть использованы как для аналитических исследований, так и в качестве терапевтических препаратов.
При получении достаточных количеств желаемого полипептида он может быть использован для различных целей. Типичный пример использования - получение специфичных по связыванию антител. Эти антитела, моноклональные или поликлональные, могут быть получены in vivo или in vitro широко известными методами.
Для получения поликлональных антител выбирают соответствующую целевую иммунную систему, обычно мышь или кролика. По существу очищенный антиген вводится в иммунную систему методом, зависящим от вида животного и ряда других параметров, хорошо известных иммунологам. Обычные способы введения - внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно и в подушечки лап. Конечно, кроме мышей и кроликов могут быть использованы животные других видов. Поликлональные антитела очищают с применением известных методов, достигая желаемой специфичности.
Силу иммунологического ответа обычно проверяют при помощи иимунологического анализа. Обычно такой анализ подразумевает некоторую степень очистки источника антигена, например вещества, продуцируемого теми же клетками и тем же способом, что и исходный антиген. Многочисленные варианты иммунологического анализа широко известны. Например, см. Harlow & Lane, 1988, или Goding, 1986. При проведении стандарных процедур, например, описанных Harlow & Lane, 1988, и Coding, 1986, получают моноклональные антитела с аффинностью 10-8 на моль или предпочтительно 10-9 на моль, 10-10 на моль или сильнее. Должны быть отобраны приемлемые животные и проведена соответствующая процедура иммунизации. По истечении соответствующего времени у иммунизированных животных вырезают селезенки и отдельные спленоциты сливают с иммортализованными клетками миеломы в соответствующих селективных условиях. Затем гибридные клетки клонируют и супернатанты отдельных клонов тестируют на наличие антител, специфичных по отношению к определенным эпитопам антигена.
К другим приемлемым методам относится экспозиция in vitro лимфоцитов с антигенными полипептидами или селекция библиотек антител в фагах или других сходных векторах (см. Huse et al., 1989). Представленные в настоящем изобретении полипептиды и антитела могут быть использованы как с модификацией, так и без нее. Часто полипептиды и антитела метят путем ковалентного или нековалентного присоединения вещества, дающего распознаваемый сигнал. Имеется широкое разнообразие методов мечения и конъюгирования, описанных как в научной, так и патентной литературе. К приемлемым меткам относятся радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные агенты, хемилюминесцентные агенты, магнитные частицы и др.
Среди патентов, посвященных применению подобных меток, можно отметить следующие: патенты США 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241. Могут быть получены также и рекомбинантные иммуноглобулины (см. патент США 4816567).
"Связывающий партнер" означает молекулу, способную связывать лиганд с высокой специфичностью. Примерами подобных агентов могут служить антиген и антигенспецифическое антитело или фермент и его ингибитор. В целом, специфические связывающие партнеры могут связываться с достаточной аффинностью с иммобилизованной копией аналита (комплементарной цепью дуплекса в случае полинуклеотидной гибридизации) в условиях изоляции. Такие специфически связывающиеся агенты известны специалистам в данной области техники; к ним относятся, например, биотин и авидин или стрептавидин, IgG и белок А, а также многочисленные хорошо известные пары типа "рецептор-лиганд" и комплементарные полинуклеотидные цепи. В случае комплементарного полинуклеотидного связывания, партнеры обычно имеют в длину по крайней мере 15 килобаз, а могут быть длиной около 40 килобаз.
"Биологический образец" означает образец ткани или жидкости индивидуума, в котором ожидается обнаружение искомого полинуклеотида или полипептида. К такого рода образцам относятся (но не ограничиваются указанными), например, плазма, сыворотка, спинно-мозговая жидкость, лимфа, секреты и отделяемое кожи, дыхательных путей, кишечника, мочеполовых путей, а также слезы, слюна, клетки крови, образцы опухолей, различных органов, тканей и составляющих клеточных культур, полученных in vitro.
Используемое здесь понятие "диагностика" или "прогнозирование" применительно к неоплазиям, означает следующее: 1) классификацию повреждения как неоплазии; 2) установление тяжести неоплазии или 3) наблюдение за прогрессией заболевания до, в течение и после лечения.
Термин "кодирование" означает следующее. Полинуклеотид, как природный, так и сконструированный с помощью хорошо известных специалистам методов, считается кодирующим полипептид, если он транскрибируется с образованием матричной РНК (мРНК), которая затем транслируется с образованием полипептида или его фрагмента. Антисмысловая цепь коплементарна указанной полинуклеотидной цепи и поэтому на ее основе может быть выведена последовательность кодирующей цепи.
Понятие "выделенный или по существу очищенный". Это понятие применяют по отношению к биологическому объекту, в частности нуклеиновой кислоте (РНК, ДНК, смешанному полимеру), в том случае, если он по существу отделен от других клеточных компонентов, которые естественным образом загрязняют нативную последовательность нуклеиновой кислоты человека или белок, в частности, от рибосом, полимераз, многих других геномных последовательностей и белков. Указанное понятие относится к нуклеиновой кислоте или белку, которые выделены из природного микроокружения, в частности к изолятам рекомбинантной или клонированной ДНК и ее химически синтезированным аналогам или же аналогам, синтезированным биологическим путем в гетерологичных системах.
Понятие "MTS-аллель" относится к нормальным аллелям MTS-локуса, так же как и к аллелям, имеющим какие-либо изменения, которые обусловливают предрасположенность индивидуума к развитию злокачественной опухоли различной локализации, например к меланоме, окулярной меланоме, лейкозу, астроцитоме, глиобластоме, лимфоме, глиоме, лимфоме Ходжкина, множественной миеломе, саркоме, миосаркоме, холангиосаркоме, чешуеклеточной карциноме, хроническому лимфобластному лимфолейкозу (CLL), а также опухолям поджелудочной железы, молочной железы, мозга, предстательной железы, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичников, матки, семенников, почек, желудка, ободочной и прямой кишки. Такие предрасполагающие аллели также называют "MTS-чувствительными аллелями".
Понятия "локус MTS"; "ген MTS", "нуклеиновая кислота MTS" и "полинуклеотид MTS" относятся к полинуклеотидам, все из которых расположены в MTS-области и с большой долей вероятности экспрессируются в нормальных тканях, причем некоторые аллели указанных полинуклеотидов обусловливают предрасположенность индивидуума к развитию меланомы и других злокачественных опухолей, например окулярной меланомы, лейкоза, астроцитомы, глиобластомы, лимфомы, глиомы, лимфомы Ходжкина, множественной миеломы, саркомы, миосаркомы, холангиосаркомы, чешуеклеточной карциномы, хроническому лимфобластному лимфолейкозу (CLL), а также опухолей поджелудочной железы, молочной железы, мозга, предстательной железы, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичников, матки, семенников, почек, желудка, ободочной и прямой кишки. Понятие "MTS-локус" используется взаимозаменяемым образом с предложенным ранее термином "MLM-локус", и применение термина "MTS-локус" означает применение термина "MLM-локус" по отношению к локусу, гену, области и т.д. Мутации в MTS-локусе могут быть вовлечены в развитие и/или прогрессию других типов опухолей. Частично локус выявлен благодаря мутациям, обусловливающим предрасположенность индивидуума к развитию злокачественных опухолей.
Указанные мутации затрагивают MTS-область, описанную ниже.
MTS-локус включает кодирующие последовательности, промежуточные последовательности и регуляторные элементы, контролирующие транскрипцию и/или трансляцию. MTS-локус включает также аллельные варианты ДНК-последовательности.
Указанные термины, когда они относятся к нуклеиновой кислоте, означают нуклеиновую кислоту, которая кодирует MTS-полипептид (включая р16), его фрагмент, гомолог или вариант, в том числе, например, белки слияния или делетированные белки.
Нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем изобретении, представляют собой последовательности, которые получены на основе природного MTS-гена, или существенным образом сходного с ним гена, или гена, имеющего с природным значительную гомологию, или же на основе фрагмента природного гена. Кодирующая последовательность для MTS-полипептида (MTS1) представляет собой SEQ ID NO: 1, аминокислотная последовательность MTS-полипептида MTS1) представляет собой
SEQ ID NO: 2. Кодирующая последовательность для второго MTS-полипептида (MTS1E1-бета) представляет собой SEQ ID NO: 13, а соответствующая аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 14. Кодирующая последовательность третьего MTS-полипептида (MTS2) представляет собой SEQ ID NO: 15, а соответствующая аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 16.
Понятие "р16" используется взаимозаменяемым образом с понятиями MTS1 и MTS1E1-бета и применяется для обозначения локуса MTS1, который кодирует р16, и локуса MTS1E1-бета, который кодирует р10. MTS1 и MTS1E1-бета - это две формы одного и того же гена, образование различных транскриптов зависит от используемого промотора. MTS2 представляет собой отдельный участок MTS-области и кодирует р15.
Полинуклеотидные соединения, описанные в настоящем изобретении, включают РНК, кДНК, геномную ДНК, синтетические молекулы, смешанные полимеры, смысловые и антисмысловые цепи, которые могут быть химически или биохимически модифицированы или могут содержать неприродные нуклеотиды, а также производные нуклеотидов. Перечисленные соединения могут быть легко получены специалистами в данной области исследований. К указанным модификациям относятся, например, мечение, метилирование, замещение одного или более природных нуклеотидов каким-либо аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как незаряженные связи (например, метилфофсфанатные, фосфотриэфирные, фосфоамидные, карбаматные и т.д.), заряженные связи (например, фосфотиоатные, фосфодитиоатные и т.д.), дополнительные группы (например, полипептидные), интеркалирующие соединения (например, акридин, псорален и т.д.), хелаторы, алкилаторы, а также модифицированные связи (например, альфа-аномерические нуклеиновые кислоты и т.д.). Кроме того, к полинуклеотидным соединениям относятся синтетические молекулы, которые имитируют способность полинуклеотидов связываться с определенной последовательностью посредством водородных связей или других химических взаимодействий. Указанные молекулы известны на уровне техники и включают, например, такие соединения, в которых пептидные связи замещены фосфатными связями в остове молекулы.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным нуклеиновым кислотам, состоящим из целой области NTS или ее части.
Рекомбинантная конструкция может автономно реплицироваться в клетке-хозяине. Альтернативно, рекомбинантная конструкция может интегрировать в хромосомную ДНК клетки-хозяина. Такой рекомбинантный полинуклеотид представляет собой полинуклеотид геномного, кДНКового, полусинтетического или синтетического происхождения и в силу своего происхождения или метода получения 1) не ассоциирован со всем или частью полинуклеотида, с которым он связан в природе; 2) связан с полинуклеотидом, отличным от того, с которым он связан в природе; 3) не встречается в природе.
Таким образом, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, заявленные в настоящем изобретении, представлены последовательностями, не встречающимися в природе. Несмотря на то что может быть использована последовательность дикого типа, чаще всего она будет изменена, например, путем делеции, замещения или инсерции.
кДНКовые или геномные билиотеки различного происхождения могут быть скринированы как природные источники нуклеиновых кислот, заявленных в настоящем изобретении, или такие нуклеиновые кислоты могут быть получены путем амплификации (например посредством ПЦР) последовательностей, входящих в состав геномной ДНК или других природных источников. Выбор кДНКовых библиотек обычно соотносится с источником ткани, богатой мРНК заданных белков. Предпочтительно использование фаговых библиотек, однако могут быть использованы и другие библиотеки. Клоны соответствующей библиотеки высевают на чашки, переносят на субстрат для скрининга, денатурируют и тестируют на присутствие заданных последовательностей.
Последовательности ДНК, используемые согласно настоящему изобретению, обычно содержат около пяти кодонов (15 нуклеотидов), более вероятно около 7-15 кодонов и наиболее предпочтительно около 35 кодонов. Кроме того, в них могут находиться один или более интронов. Указанное количество нуклеотидов обычно обеспечивает минимальную длину, необходимую для того, чтобы служить в качестве пробы, которая будет специфически гибридизоваться с MTS-кодирующей последовательностью.
Методики работы с нуклеиновыми кислотами описаны, например Sambrook et al., 1989 или Ausubel et al., 1992. Реагенты, используемые при осуществлении данных методик, например ферменты рестрикции и т.д., широко известны и коммерчески доступны. Например, их поставляют такие фирмы как New England Biolabs, Boehringer Mannheim, Amersham, Promega Biotec, U.S.Biochemicals, New England Nuclear и другие. Рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, используемые для получения белков слияния согласно настоящему изобретению, могут происходить из природных или синтетических последовательностей.
Многие природные генные последовательности получают из различных кДНКовых или геномных библиотек с помощью соответствующих проб. Более подробную информацию можно получить в Генном банке Национального Института здравоохранения США.
Понятие "MTS-область" относится к участку девятой хромосомы человека, содержащейся в P1-клонах Р1-1062 и Р1-1063. Указанные P1-клоны в составе E. coli NS 3529 депонированы в Американской коллекции клеточных культур, Роквилл, Мэриленд, США 16 марта 1994 г. и обозначены АТСС N 69589 и 69590 соответственно. Указанная область содержит MTS-локус, включая гены MTS1, MTS2 и MTS1E1-бета.
Используемые здесь понятия "MTS-локус", "MTS-аллель" и "MTS-область" относятся к двуцепочечной ДНК, содержащей локус, аллель или область, а также и к одноцепочечной ДНК, содержащей локус, аллель или область.
Используемое здесь понятие "часть" MTS-локуса или области, или аллеля обозначает участок минимального размера, длиной около восьми нуклеотидов, предпочтительно длиной около 15 нуклеотидов, более предпочтительно длиной около 25 нуклеотидов, а также это может быть участок, минимальный размер которого составляет по крайней мере около 40 нуклеотидов.
Понятие "MTS-белок" или "MTS-полипептид" относится к белку или полипептиду, который кодируется MTS-локусом (в том числе, к MTS1-полипептиду, MTS2-полипептиду и MTS1E1-бета полипептиду), а также вариантам или фрагментам соответствующего белка или полипептида. Понятием "полипептид" обозначаются полимеры, состоящие из аминокислот и их эквиваленты, и не связано с длиной указанных соединений. Таким образом, пептиды, олигопептиды и белки охватываются понятием "полипептид". Данное понятие не относится к модифицированным полипептидам, например гликозилированным, ацетилированным, фосфорилированным и т. д., однако относится к полипептидам, содержащим один или более аминокислотных аналогов (в том числе, неприродных аминокислот и т.д.), полипептидам с замещенными связями, так же как и с другими известными модификациями природного и неприродного происхождения. Обычно такие полипептиды имеют по крайней мере 50% гомологии с нативной MTS-последовательностью, предпочтительно 90% гомологии и наиболее предпочтительно по крайней мере 95% гомологии. Кроме того, к указанным полипептидам относятся белки, кодируемые ДНК, которая гибридизуется с MTS-кодирующей последовательностью в мягких или жестких условиях гибридизации, а также близкородственные полипептиды или белки, распознаваемые сывороткой к MTS-белку (белкам).
Длина полипептидных последовательностей, сравниваемых по гомологии, в целом составляет по крайней мере около 16 аминокислот, обычно около 20 аминокислотных остатков, более часто около 24 остатков, наиболее вероятно около 28 остатков и предпочтительно более 35 остатков.
Понятие "функционально связанный" относится к определенному расположению компонентов, которые при этом соединены таким образом, что могут функционировать, как это задано целью эксперимента. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он обеспечивает ее транскрипцию или экспрессию.
"Пробы". Этим термином обозначают полинуклеотидные полиморфизмы, ассоциированные с MTS-аллелями, которые обусловливают предрасположенность к различным злокачественным опухолям, или ассоциированные с большинством злокачественных опухолей, причем данные полинуклеотиды определяются в результате гибридизации с полинуклеотидной пробой, формирующей стабильный гибрид с последовательностью-мишенью в строгих и умеренных условиях гибридизации и при отмывании. Если предполагается, что пробы будут строго комплементарны последовательности-мишени, следует использовать жесткие условия гибридизации. Условия могут быть менее жесткими, если ожидается незначительная степень перекрывания, например в случае вариантов, когда проба не будет полностью комплементарна мишени. Условия гибридизации выбирают таким образом, чтобы исключить поверхностное или неспецифическое связывание и свести к минимуму эффект фона. Поскольку в результате таких определений идентифицируют нейтральные ДНК-полиморфизмы, так же как и мутации, необходимы дополнительные исследования для подтверждения выявления MTS-чувствительного аллеля. Пробы для MTS-аллелей могут быть получены на основе последовательностей MTS-области или соответствующих кДНК. Пробы могут иметь любую подходящую длину, чтобы перекрыть целую MTS-область или ее часть и обеспечить специфическую гибридизацию с MTS-областью. Если последовательность-мишень содержит последовательность, идентичную пробе, то пробы могут быть короче, например в среднем около 8-10 пар нуклеотидов, так что гибрид будет относительно стабильным даже в жестких условиях гибридизации. Если при использовании пробы ожидается определенная степень несовпадения, например, если происходит гибридизация с вариантом области, то для гибридизации с последовательностью-мишенью может быть использована более длинная проба с заданной специфичностью.
Под пробой понимают выделенный полинуклеотид, соединенный с меткой или репортерной молекулой, который может быть использован для выделения других полинуклеотидных последовательностей, имеющих сходство, выявляемое стандартными методами. Методы получения и мечения проб описаны, например, Sambrook et al. , 1989 или Ausubel et al., 1992. Другие сходные полинуклеотиды могут быть отобраны с использованием гомологичных полинуклеотидов. Альтернативно, полинуклеотиды, кодирующие данные или сходные полипептиды, могут быть синтезированы или отобраны на основе избыточности генетического кода. Могут быть произведены различные замены кодонов, например так называемые "молчащие" замены (с созданием различных сайтов рестрикции). Одной из целей подобных замен может явиться оптимизация экспрессии в конкретной системе. Для модификации свойств полипептидов могут быть введены мутации, в частности для изменения лигандсвязывающих аффинностей, междуцепочечных аффинностей или скоростей кругооборота и деградации полипептидов.
Пробы, представляющие собой синтетические олигонуклеотиды или другие полинуклеотиды, заявленные в настоящем изобретении, могут быть получены из природных или рекомбинантных одно- или двуцепочечных полинуклеотидов, или же химически синтезированы. Пробы могут быть помечены ник-трансляцией, при помощи Кленовских фрагментов или другими известными методами.
В качестве проб применимы участки нуклеотидных последовательностей, представляющие по меньшей мере восемь, предпочтительно 15 нуклеотидов, реже до 6 килобаз, обычно до 1 килобазы нуклеотидной последовательности, кодирующей MTS. Пробы также могут быть использованы для обнаружения в клетках и тканях РНК, кодируемой MTS.
Понятием "модификации и фрагменты" применительно к настоящему изобретению обозначают полипептиды или фрагменты MTS, которые по существу гомологичны первичной структурной последовательности, однако имеют (например, in vivo или in vitro) химические или биохимические изменения или же содержат нетипичные аминокислоты. К подобным изменениям, например, относятся ацетилирование, карбоксилирование, фосфорилирование, гликозилирование, убиквитирование, мечение, например, радионуклидами, а также различные модификации, полученные с помощью ферментов, что хорошо известно специалистам в данной области исследований. Различные способы мечения полипептидов, а также заместители и метки, используемые для этих целей, известны из уровня техники. К ним относятся радиоактивные изотопы, такие как 32Р, лиганды, которые связываются с мечеными антилигандами (например, антителами), флуорохромы, хемилюминесцентные агенты, ферменты и антилиганды, способные служить специфическим связывающим партнером для меченого лиганда. Выбор метки зависит от требуемой чувствительности, легкости конъюгирования с праймером, необходимой стабильности и доступности оборудования. Методы мечения полипептидов известны специалистам. См., например, Sambrook et al., 1989, или Ausubel et al., 1992.
Помимо полипептидов полной длины, настоящее изобретение относится и к биологически активным фрагментам данных полипептидов. Существенными биологическим активностями являются способность к связыванию лигандов, иммунологическая активность и другие виды биологической активности MTS-полипептидов. Иммунологическая активность соединения означает, во-первых, что данное соединение обладает иммуногенными свойствами по отношению к иммунной системе и, во-вторых, наличие у него связывающих иммунологических эпитопов, что обеспечивает его функционирование в качестве конкурентного или замещающего антигена для эпитопа MTS-белка. Используемый здесь термин "эпитоп" означает антигенную детерминанту полипептида. Эпитоп может содержать три аминокислоты определенной пространственной конформации, которые уникальны для данного эпитопа. В целом эпитоп состоит по крайней мере из пяти аминокислот, более вероятно - из 8-10 аминокислот. Методы определения пространственной конформации такого рода аминокислот хорошо известны из уровня техники.
Для иммунологических целей в качестве иммуногенов могут использоваться тандемно-повторяющиеся полипептидные сегменты, обладающие высокой антигенностью. Альтернативно, такие полипептиды могут служить очень эффективными заместителями в реакциях специфического связывания. Получение антител, специфически взаимодействующих с MTS-полипептидами или их фрагментами, описано ниже.
Настоящее изобретение относится также к полипептидам слияния, содержащим MTS-полипептиды и их фрагменты. Гомологичные полипептиды могут располагаться между двумя или более MTS-полипептидными последовательностями или между MTS-последовательностями и родственным белком. Подобно этому могут быть получены гетерологичные слияния с ожидаемой комбинацией свойств или активностей тех белков, которые использовались для слияния. Например, связывающие лиганд или другие домены могут быть встроены между различными, вновь полученными полипептидами слияния или их фрагментами. Такого рода гомологичные или гетерологичные полипептиды слияния могут обладать, например, измененными силой или специфичностью связывания. Партнерами слияния могут служить иммуноглобулины, бактериальная бета-галактозидаза, trp E, белок А, бета-лактамаза, альфа-амилаза, алкогольдегидрогеназа и дрожжевой фактор спаривания. См., например, Godowski et al., 1988.
Белки слияния обычно получают методами рекомбинантных нуклеиновых кислот, как описано ниже, или путем химического синтеза. Методики синтеза полипептидов описаны, например, Merrifield, 1963.
Понятие "очистка белка" относится к различным методам выделения MTS-полипептидов из биологического материала, например из клеток, трансформированных рекомбинантными нуклеиновыми кислотами, кодирующими MTS. Указанные методы хорошо известны из уровня техники. Например, полипептиды могут быть очищены иммуноаффинной хроматографией, скажем, при использовании антител, полученных согласно настоящему изобретению. Различные методы очистки белков известны специалистам и описаны, например, Deutscher, 1990, и Scopes, 1982.
Понятия "выделенный", "по существу очищенный" и "по существу гомогенный" используются как взаимозаменяемые по отношению к белку или полипептиду, который отделен от компонентов, связанных с ним в природном материале. Мономерный белок считается по существу очищенным, когда по крайней мере около 60-70% образца представляет собой определенную полипептидную последовательность. По существу очищенный белок обычно составляет от 60 до 90% по весу в образце белка, предпочтительно - 95%, а еще более предпочтительно - около 99%.
Чистоту и гомогенность белка определяют многими хорошо известными способами, такими как электрофорез в полиакриламидном геле.
"Гомология или сходство по существу". Нуклеиновая кислота или ее фрагмент "гомологична по существу" (или "сходна по существу") другой нуклеиновой кислоте, если при оптимальном расположении (с соответствующими инсерциями или делециями нуклеотидов) обнаруживает идентичность нуклеотидной последовательности не менее чем на протяжении 60% нуклеотидов, обычно не менее 70%, более часто не менее 80%, предпочтительно не менее 90% и еще более предпочтительно около 95-98% нуклеотидов.
Альтернативно, гомология (или сходство) по существу имеет место, когда нуклеиновая кислота или ее фрагмент гибридизуется с другой нуклеиновой кислотой (или с комплементарной цепью) в определенных гибридизационных условиях. При гибридизации имеет место избирательность. Обычно избирательность гибридизации наблюдается при 55%-ной гомологии фрагментов не менее 14 нуклеотидов длиной, лучше - около 65%, предпочтительно - не менее 75% и еще более предпочтительно - не менее 90%. Cм. Kanehisha, 1984. При этом длина гомологичного сопоставления может быть значительной, в отдельных случаях она может превышать девять нуклеотидов, обычно не менее 20 нуклеотидов, чаще - не менее 24 нуклеотидов, лучше - 28 нуклеотидов, еще лучше - 32 нуклеотида и совсем предпочтительно - 36 или более нуклеотидов.
На гибридизацию нуклеиновых кислот влияют такие условия, как концентрация солей, температура, наличие органических растворителей, а, кроме того, - состав оснований, длина комплементарных фрагментов, число несовпадений нуклеотидных оснований между гибридизующимися нуклеиновыми кислотами. Все эти факторы хорошо известны специалистам. Под жесткими температурными условиями понимают температуру выше 30oC, обычно - выше 37oC и предпочтительно - выше 45oC. Под жесткими солевыми условиями понимают концентрацию солей менее 1000 мМ, обычно - менее 500 мМ и предпочтительно - менее 200 мМ. Однако комбинация параметров более важна, чем величина одного из них. См., например, Wetmur & Davidson, 1968.
При определенных условиях пробы могут также гибридизоваться с дуплексными ДНК с образованием триплексов или комплексов ДНК более высокого порядка. Получение таких проб и подходящие условия гибридизации известны из уровня техники.
Термины "гомология по существу" или "идентичность по существу" применительно к полипептидам указывают на то, что исследуемый полипептид или белок проявляет по меньшей мере 30%-ную идентичность с полным природным белком или его частью, обычно не менее 70%-ной идентичности и предпочтительно не менее 95%-ной идентичности.
"По существу сходная функция" относится к функции модифицированной нуклеиновой кислоты или модифицированного полипептида по сравнению с нуклеиновой кислотой MTS дикого типа или полипептидом MTS дикого типа. Модифицированный полипептид будет по существу гомологичен полипептиду MTS дикого типа и, соответственно, будет иметь по существу ту же самую функцию, т.е. будет ингибировать Cdk, в особенности Cdk4. Модифицированный полипептид может иметь измененную аминокислотную последовательность и/или может содержать модифицированные аминокислоты. Помимо функции ингибирования Cdk, модифицированный полипептид может обладать другими полезными свойствами, такими как более длительный срок полужизни. Cdk-ингибиторная активность модифицированного полипептида может быть по существу той же самой, что и у полипептида MTS дикого типа. Напротив, Cdk-ингибиторная активность модифицированного полипептида может быть выше, чем активность полипептида MTS дикого типа. Модифицированный полипептид синтезируют с использованием обычных методов, или же он может быть кодирован модифицированной нуклеиновой кислотой и получен обычными методами. Модифицированную нуклеиновую кислоту получают обычными методами. Нуклеиновая кислота с функцией, по существу сходной с функцией гена MTS дикого типа, может служить для получения описанного выше модифицированного белка.
Применительно к полипептидам гомологию обычно определяют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей. См., например, Sequence Analysis Software Package компании Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. С помощью компьютерных программ для анализа белков проводят сравнение сходных последовательностей, измеряя степень гомологии с учетом различных замен, делеций и других модификаций. К консервативным заменам обычно относятся замены следующих групп: глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин.
Полипептидный "фрагмент", "участок" или "сегмент" - это ряд аминокислотных остатков, состоящий по меньшей мере из пяти - семи последовательных аминокислот, часто из семи - девяти последовательных аминокислот, обычно из девяти - 13 последовательных аминокислот и наиболее предпочтительно - из 20-30 или более последовательных аминокислот.
Полипептиды, заявленные в настоящем изобретении, если они растворимы, могут быть связаны с твердым субстратом, например нитроцеллюлозой, нейлоном, материалами для заполнения колонок (например, частицами сефарозы), магнитными бусами, стеклянной ватой, пластиком, металлом, полимерными гелями, клетками или другими субстрататми. Такие подложки могут иметь, например, форму бус, лунок, палочек или мембран.
"Область-мишень" обозначает область нуклеиновой кислоты, которая должна быть амплифицирована и/или обнаружена. Термин "последовательность-мишень" обозначает последовательность, с которой проба или праймер образуют стабильный гибрид при определенных условиях.
При воплощении настоящего изобретения использованы, если это не оговорено специально, обычные методы химии, молекулярной биологии, микробиологии, генной инженерии, генетики и иммунологии. См., например, Maniatis et al., 1982; Sambrook et al. , 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie & Fink, 1991. Общее обсуждение материалов и методов для картирования хромосом человека, включая картирование хромосомы 9р, приведено, например, White & Lalouel, 1988.
Получение рекомбинантных или химически синтезированных кислот: векторы, трансформация, клетки-хозяева
Большие количества заявленных в настоящем изобретении полинуклеотидов могут быть получены путем репликации в соответствующей клетке-хозяине. Природные или синтетические полинуклеотиды, кодирующие желаемый фрагмент, должны быть встроены в рекомбинантные полинуклеотидные конструкции, обычно ДНК-конструкции, способные к введению и репликации в прокариотических или эукариотических клетках. Обычно полинуклеотидные конструкции разрабатывают для репликации в одноклеточном хозяине, таком как дрожжи или бактерии, но могут быть получены конструкции, предназначенные для введения (с интеграцией или без интеграции с геномом клетки) в культивируемые клетки млекопитающих, растений или эукариотические клетки другого происхождения. Очистку нуклеиновых кислот, заявленных в настоящем изобретении, проводят по методам, описанным, например, Sambrook et al., 1989, или Ausubel et al., 1992.
Заявленные в настоящем изобретении полинуклеотиды могут быть получены химическим синтезом, например, фосфорамидитовым методом, как описано Beaucage & Carruthers, 1981, или триэфирным методом, как описано Matteucci et al. , 1981. Синтез может осуществляться на коммерческих автоматических синтезаторах олигонуклеотидов. Двуцепочечный фрагмент может быть получен на основе одноцепочечного продукта химического синтеза или путем синтеза комплементарной цепи с последующим совместным отжигом обеих цепей в соответствующих условиях, или же достройкой второй комплементарной цепи ДНК-полимеразой с использованием соответствующих праймерных последовательностей.
Полинуклеотидные конструкции, предназначенные для введения в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, должны содержать узнаваемую хозяином репликативную систему, включающую целевой полинуклеотидный фрагмент, кодирующий нужный полипептид, а также регуляторные последовательности для инициации транскрипции и трансляции, функционально связанные с кодирующими последовательностями. В состав векторов экспрессии могут включаться, например, сайты начала репликации или автономно реплицирующиеся последовательности (ARS); последовательности, контролирующие экспрессию, промотор, энхансер; сайты, необходимые для процессинга, такие как сайт связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования, терминаторы транскрипции и последовательности стабилизации мРНК.
При необходимости могут быть включены сигналы секреции, взятые от нативного белка MTS, других рецепторов или других секретируемых полипептидов того же или родственных видов. Данные сигналы позволяют белку проходить через клеточные мембраны и/или закрепляться в них сохраняя, функциональную топологию, или же секретироваться из клетки. Указанные векторы могут быть получены стандартными методами рекомбинации, описанными, например, Sambrook et al., 1989, или Ausubel et al., 1992.
Выбор соответствующего промотора и других важных последовательностей вектора определяется требованиями функциональности в данном хозяине, и при определенных условиях могут быть выбраны последовательности, ассоциированные с MTS-геном в природе. Примеры полезных комбинаций клеточных линий и векторов экспрессии приведены Sambrook et al., 1989, или Ausubel et al., 1992; см. также, например, Metzger et al., 1988. Многие удобные векторы можно получить от таких поставщиков, как Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech и других. В прокариотических клетках-хозяевах могут использоваться такие промоторы, как trp, lac, фаговые промоторы, промоторы тРНК и промоторы гликолитических ферментов. Удобные дрожжевые промоторы включают промоторы металлотионеина, 3-фосфоглицерат киназы или других гликолитических ферментов, таких как енолаза или глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, промоторы ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Векторы и промоторы, удобные для использования в дрожжах, описаны Hitzeman et al., ЕР 73675А. В число промоторов, приемлемых для экспрессии в клетках млекопитающих, входят ранний и поздний промотор вируса SV40 (Fiers et al., 1978), промоторы вируса лейкоза мышей Молони, вируса рака молочной железы мышей, вирусов саркомы птиц, аденовируса II, вируса бычьей папилломы или вируса полиомы. Кроме того, в состав конструкции может быть включен амплифицируемый ген (например, ген дегидрофолатредуктазы, DHFR), что позволяет получить множественные копии вводимого гена. Описание приемлемых энхансеров и других последовательностей, влияющих на экспрессию, см. также в Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1983).
При том что подобные векторы экспрессии могут реплицироваться автономно, можно достичь их репликации в интегрированном состоянии в геноме клетки-хозяина.
Векторы экспрессии и клонирования должны содержать селективный маркер-ген, кодирующий белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина, трансформированной вектором. Наличие этого гена дает возможность выживать только тем клеткам, которые экспрессируют вставку. Обычно селективные гены кодируют белки, которые а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсическим веществам, например к ампициллину, неомицину, метотрексату и др. ; b) комплементируют ауксотрофные дефициты, или c) поставляют важные питательные компоненты, не содержащиеся в среде, например ген, кодирующий D-аланин рацемазу бацилл. Выбор соответствующего селективного маркера зависит от типа используемых клеток-хозяев; хорошо известны приемлемые маркеры для различных хозяев.
Векторы, которые содержат представляющую интерес нуклеиновую кислоту, могут быть транскрибированы in vitro и полученная РНК введена в клетку одним из известных методов, например микроинъекцией (см. Kubo et al., 1988), или же векторы могут быть прямо введены в клетки при помощи методов, зависящих от типа клеток, например электропорацией, трансфекцией с применением хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ. Могут быть применены бомбардировка клеток микрочастицами, липофекция, инфицирование (когда вектор представляет собой инфекционный агент, например ретровирус) и другие методы. см. Sambrook et al., 1989, и Ausubel et al., 1992. Введение полинуклеотидов в клетку-хозяина любым из известных методов, включая inter alia, рассматривается как "трансформация". Под клетками, в которые введены описанные выше нуклеиновые кислоты, подразумевается также и потомство указанных клеток.
Большие количества заявленных в настоящем изобретении нуклеиновых кислот и полипептидов могут быть получены путем экспрессии нуклеиновых кислот MTS или их фрагментов при помощи векторов в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках. Наиболее часто используемыми прокариотическими клетками-хозяевами являются клетки различных штаммов Escherichia coli, хотя могут быть использованы и другие прокариоты, такие как Bacillus subtilis или Pseudomonas.
Для получения заявленных в настоящем изобретении белков могут использоваться клетки млекопитающих и клетки других эукариот, например дрожжей, нитчатых грибов, растений, насекомых, амфибий или птиц. Наращивание клеток млекопитающих в культуре per se хорошо известно. Cм. Jakoby and Pastan (eds. ), 1979. Примерами широко используемых клеточных линий млекопитающих могут служить клетки VERO, HeLa, CHO (клетки яичника китайского хомячка), WI38, BHK и COS, хотя в отдельных случаях клетки других линий могут оказаться более приемлемыми, например, из-за более высокого уровня экспрессии, желаемого характера гликозилирования или в силу других особенностей.
Клоны отбирают с использованием маркеров, введенных в состав конструкции. Маркерный ген может находиться в той же молекуле ДНК, что и экспрессируемый ген, а может и на другой. Первый вариант предпочтительней. В случае прокариотического хозяина трансформанты можно отобрать, например, по устойчивости к ампициллину, тетрациклину или другим антибиотикам.
Удобным маркером может служить образование конкретного продукта только при определенной температуре (температурочувствительная экспрессия).
Прокариотические и эукариотические клетки, трансформированные заявленными в настоящем изобретении полинуклеотидами, могут служить не только для получения нуклеиновых кислот и полипептидов, но также, например, для изучения свойств полипептидов MTS.
Антисмысловые полинуклеотидные последовательности полезны для предотвращения или снижения экспрессии локуса MTS, что очевидно для опытного
исследователя. Например, полинуклеотидные векторы, содержащие целый локус MTS или его часть, или же другие последовательности из области MTS (в частности, фланкирующие MTS локус) могут быть помещены под контроль промотора в антисмысловой ориентации и введены в клетку. Экспрессия такого антисмыслового конструкта в клетке будет интерферировать с транскрипцией, и/или трансляцией, и/или репликацией MTS.
Циклин и Cdks являются убиквитарными элементами контроля клеточного цикла у эукариот. Эти белки были первоначально обнаружены у дрожжей, затем найдены у морских беспозвоночных, амфибий и млекопитающих, включая мышь, кролика и человека. Гомологичные гены, отвечающие за контроль клеточного цикла, обнаружены и у животных других видов с применением проб и/или праймеров, основанных на последовательности гена, установленной для одного биологического вида. Так, пробы и праймеры, основанные на последовательностях гена MTS, описанных в настоящем изобретении, использованы для идентификации гомологичных последовательностей гена MTS и белков у других видов.
Указанные белки и последовательности гена MTS использованы для диагностики/прогнозирования, терапии и скрининга лекарств применительно к тому биологическому виду, из которого они были выделены.
Способы применения: диагностика с помощью нуклеиновых кислот и диагностические наборы
Для того чтобы установить наличие аллеля MTS, обусловливающего предрасположенность индивидуума к раку, биологический образец, например, пробу крови анализируют на наличие или отсутствие чувствительных аллелей MTS. Для установления факта наличия опухоли, определения прогрессии в злокачественности или получения прогностического индикатора анализируют биологический образец из места повреждения на наличие или отсутствие неопластических аллелей MTS. Результаты этих анализов и их интерпретация направляются врачу для последующего сообщения больному. Данная диагностика может осуществляться в диагностических лабораториях или же диагностические наборы могут продаваться врачам или даже больным для самодиагностики.
Исходно методы скрининга подразумевали амплификацию значимых MTS-последовательностей, т. е. использование ПЦР, с последующим секвенированием ДНК. Другое, более предпочтительное воплощение данного изобретения предусматривает использование для скрининга стратегии, исключающей использование ПЦР. Эти методы скрининга подразумевают хорошо известный подход двуэтапной амплификации с меткой. Обе стратегии, с использованием ПЦР и исключающая ее, дают возможность обнаруживать искомые последовательности с высокой чувствительностью.
Наиболее популярным на сегодня методом является целевая амплификация. В этом случае целевая последовательность нуклеиновой кислоты амплифицируется полимеразами. Самым предпочтительным методом полимеразной амплификации является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Основанная на использовании ПЦР стратегия и ее применение в контексте настоящего изобретения приведены в примере 1. ПЦР и другие полимеразные методы амплификации могут дать более чем миллионнократное обогащение числа копий в ходе циклов амплификации. После амплификации полученная нуклеиновая кислота может быть секвенирована или использована как субстрат для ДНК-проб.
При использовании ДНК-проб для обнаружения целевых последовательностей (например, при скрининге на чувствительность к опухолям) биологический образец, предназначенный для анализа, например проба крови, должен быть соответствующим образом обработан с целью выделения нуклеиновых кислот. Для облегчения обнаружения целевой последовательности нуклеиновые кислоты, выделенные из пробы, могут быть обработаны различными способами, например денатурированы, рестрицированы, фракционированы электрофорезом или подвергнуты дот-блоттингу. Целевая область в анализируемой нуклеиновой кислоте должна быть по меньшей мере частично одноцепочечной, чтобы образовать гибриды с последовательностью пробы. Если эта последовательность исходно одноцепочечная, то денатурации не требуется. Однако, если последовательность двуцепочечная, ее необходимо денатурировать. Денатурацию проводят одним из известных способов.
Анализируемую нуклеиновую кислоту и пробу инкубируют в условиях, способствующих образованию стабильного гибрида между целевой последовательностью пробы и искомой последовательностью в образце. Та область пробы, которая используется для связывания с анализируемой нуклеиновой кислотой, может быть сделана полностью комплементарной целевой области хромосомы человека 9р. Для предотвращения псевдоположительных результатов гибридизацию следует проводить в жестких условиях. Однако жесткие условия гибридизации необходимы только в том случае, если пробы комплементарны тем областям хромосомы, которые уникальны в геноме. Жесткость условий гибридизации определяется рядом факторов, влияющих на этапах гибридизации и последующих отмывок. К ним относятся температура, ионная сила, состав оснований, длина пробы и концентрация формамида. Эти факторы описаны, например, Maniatis et al. , 1982, и Sambrook et al., 1989. При определенных условиях для обнаружения целевой последовательности желательным может быть образование гибридов высшего порядка, таких как триплексы, квадруплексы и т.д.
Обычно обнаружение образовавшихся гибридов упрощается применением меченых проб. Наоборот, проба может быть немеченой, но выявляться посредством прямого или непрямого связывания с меченым лигандом. Приемлемые метки, а также методы мечения проб и лигандов хорошо известны и включают, например, радиоактивные метки, включаемые известными методами (например, ник-трансляцией, случайным праймированием или кинированием), биотин, флуоресцентные группы, хемилюминесцентные группы (например, диоксиэтаны, частично триггированные диоксиэтаны), ферменты, антитела и др. Вариации этих основных схем многообразны и направлены в основном на облегчение отделения искомых гибридов от окружающего материала и/или усиление сигнала меченого компонента. Ряд таких вариаций описан, например Mattews & Kricka, 1988; Landegren et al., 1988; Mittin, 1989:; US Patent 4868105 и в публикации EPO N 225807.
Как указывалось выше, в настоящее изобретение включена стратегия скрининга, исключающая использование ПЦР. Примерная процедура, проводимая без ПЦР, приведена в примере 15. Согласно данному подходу пробу нуклеиновой кислоты (или ее аналог, например метил-фосфонатный каркас, заменяющий нормальный фосфодиэфир) гибридизуют с целевой ДНК. К пробе может быть ковалентно присоединен фермент, так чтобы эта ковалентная связь не нарушала специфичности гибридизации. Затем комплекс "фермент - проба - конъюгат - целевая нуклеиновая кислота" отделяют от свободного коъюгата "проба - фермент" и добавляют субстрат для выявления фермента. Об энзиматической активности судят по развитию окраски или по регистрации люминесценции, что в тысячу - миллион раз увеличивает чувствительность. В качестве примера приготовления конъюгата "полигонуклеотидщелочная фосфатаза" и его применения в качестве гибридизационной пробы можно указать работу Jablonski et al., 1986.
Известна также методология двуэтапной амплификации с меткой. Этот метод основан на том, что малый лиганд (например, дигоксигенин, биотин или подобный им) конъюгируют с нуклеотидной пробой, способной специфически связываться с MTS. Примером пробы на MTS1 может служить нуклеотидная проба, соответствующая нуклеотидам с 448 по 498 последовательности SEQ ID NO: 4. Аллельспецифические пробы также включены в данный пример и перекрывают предрасполагающие мутации, суммированные в табл. 3, и соматические мутации в опухолях, суммированные в табл. 5.
В одном случае малый лиганд, конъюгированный с нуклеотидной пробой, специфически распознается конъюгатом антитело - фермент. Например, нуклеотидная проба конъюгирована с дигоксигенином. Гибридизацию обнаруживают посредством конъюгата антитело - щелочная фосфатаза, который активирует хемилюминесцентный субстрат. Методы мечения нуклеиновых кислот, уместные в контексте данного изобретения, описаны Martin et al., 1990.
В другом случае малый лиганд распознают посредством второго конъюгата лиганд - фермент, который способен образовывать специфический комплекс с первым лигандом. Хорошо известным воплощением этого подхода служит взаимодействия типа биотин - авидин. Методы мечения нуклеиновых проб и их использование в тестах, основанных на применении биотин-авидина, описаны Rigby et al., 1977 и Nguyen et al., 1992.
В контекст настоящего изобретения включено использование смеси нуклеотидных проб, способных обнаруживать гены MTS. Так, в одном из примеров для обнаружения MTS1 в клеточном образце использовали более чем одну пробу, комплементарную MTS1, в частности 2, 3 или 5 различных нуклеотидных проб. В другом примере для обнаружения мутаций в последовательностях гена MTS1 у больного использовали более чем одну комплементарную MTS1 пробу, в частности смесь проб, способных связываться с аллельспецифическими мутациями, идентифицированными в популяции больных с нарушениями MTS1. При этом подходе может быть использовано любое число проб, которые предпочтительно должны состоять из проб, соответствующих главным генным мутациям, предрасполагающим индивидуума к раку молочной железы. Некоторые возможные пробы, заявленные в настоящем изобретении, имеют аллельспецифические мутации, приведенные в табл. 3 и 5.
Способы применения: пептидная диагностика и диагностические наборы
Неопластические состояния можно диагностировать, исходя из изменений полипептида MTS дикого типа. Подобные изменения можно обнаружить секвенированием с применением стандартных методов. Предпочтительно использовать антитела (поликлональные или моноклональные) для обнаружения отличий (или их отсутствия) в MTS-пептидах. В предпочтительном воплощении данного изобретения антителами иммунопреципитируют белки MTS из раствора или же эти антитела реагируют с MTS-белком на Вестерн- или иммуноблотах полиакриамидных гелей. В другом воплощении антитела распознают MTS-белок в парафиновых или замороженных срезах тканей при постановке иммуноцитохимических методов. Методы получения и очистки антител широко известны и любой из этих методов может быть выбран для достижения целей настоящего изобретения. Для обнаружения пептидов MTS и мутаций данных пептидов могут применяться ферментсвязанный иммуносорбентный метод (ELISA), радиоиммунологический метод (RIA), иммунорадиометрический метод (IRMA) и иммуноэнзиматический метод (IEMA), включая сэндвич-метод с применением моноклональных и/или поликлональных антител. Примеры сэндвич-метода описаны David et al., в US Patent NN 4376110 и 4486530, включенных в качестве ссылок и приведенных в примере 18.
Способы применения: скрининг соединений
Настоящее изобретение применимо для скрининга соединений с использованием полипептидов Cdk или их связывающихся фрагментов в любой из многообразных процедур скрининга препаратов.
Предпочтительно использовать Cdk4. Пептид Cdk или его фрагмент, используемые в данном тесте, могут быть в виде раствора, фиксироваться на твердом субстрате или находиться на клеточной поверхности. В одном из методов скрининга веществ, основанном на конкурентном связывании, используют эукариотические или прокариотические клетки-хозяева, стабильно трансформированные рекомбинантными полинуклеотидами и экспрессирующие полипептид или его фрагменты. Эти клетки в живом или фиксированном состоянии могут быть использованы в стандартных экспериментах по связыванию. Можно определить, например, образование комплексов между полипептидом Cdk или его фрагментом с анализируемым агентом, или определить в какой степени анализируемый агент влияет на образование комплекса между полипептидом Cdk (или его фрагментом) и полипептидом MTS (или его фрагментом).
Таким образом, в настоящем изобретении представлены методы скрининга препаратов, основанные на связывании тестируемого препарата с полипептидом Cdk и позволяющие определять: 1) наличие комплекса между тестируемым агентом и полипептидом Cdk или его фрагментом, или 2) наличие комплекса между полипептидом Cdk или его фрагментом и лигандом.
Измеряют также активность Cdk для установления способности тестируемого агента ингибировать Cdk и, соответственно, регулировать клеточный цикл. В таких конкурентных тестах полипептид Cdk или его фрагмент обычно метят. Свободный полипептид Cdk или его фрагмент отделяют от связанного в белок/белковом комплексе, и количество свободной (т.е. несвязанной) метки является показателем связывания тестируемого агента с Cdk или же показателем интерференции первого со связыванием Cdk:MTS. Небольшие участки полипептида MTS (пептиды-миметики) анализируют этим методом для идентификации тех пептидов, которые обладают ингибиторной активностью в отношении Cdk.
Другой высокопроизводительный метод скрининга соединений, обладающих аффинностью в отношении полипептидов Cdk, описан Гейзеном (Geysen, European Patent Application N 84/03664, опубликована 13 сентября 1984 г.). Кратко, большое число различных пептидов, которые должны быть проверены, синтезируют на твердом субстрате, например пластиковых палочках или какой-либо другой поверхности. Этим пептидам дают прореагировать с полипептидом Cdk и отмывают. Связанный полипептид Cdk затем выявляют известными методами.
Очищенный Cdk может быть нанесен на планшеты для использования в упомянутых выше методах скрининга лекарств. Однако можно использовать ненейтрализующие антитела к полипептиду для иммобилизации Cdk на твердой фазе.
В настоящем изобретении заявлено также использование конкурентных тестов скрининга, в которых нейтрализующие антитела, способные специфически связывать полипептид Cdk, конкурируют с тестируемым соединением за связывание с полипептидом Cdk или его фрагментом. Таким образом, антитела используют для обнаружения любого пептида, имеющего одну или более общих антигенных детерминант с полипептидом Cdk.
Другие методы скрининга препаратов подразумевают использование линий эукариотических клеток или клеток (подобных описанным выше), имеющих нефункциональный ген MTS. Подобные клеточные линии или клетки дефектны в отношении контроля клеточного цикла на уровне Cdk. Такие клетки выращивают в присутствии тестируемого вещества. Определяют скорость роста клеток и на основе этих данных делают вывод о способности тестируемого вещества регулировать клеточный цикл. Один из способов определения скорости роста состоит в определении биологической активности отдельных Cdk, предпочтительно Cdk4.
Способы применения: рациональный дизайн лекарств
Целью рационального дизайна лекарств является создание структурных аналогов биологически активных полипептидов или малых молекул, с которыми они взаимодействуют (например, агонистов, антагонистов, ингибиторов), для получения препаратов, которые, например, представляют собой более активные или стабильные формы полипептидов, которые усиливают или же подавляют функцию полипептида in vivo. См. например, Hodgson, 1991.
При одном из подходов сначала определяют трехмерную структуру представляющего интерес полипептида (например, р16 или Cdk4) или же комплекса Cdk4-pl6 при помощи рентгеновской кристаллографии, компьютерного моделирования или, чаще, сочетанием этих методов. Реже полезная информация относительно структуры полипептида может быть получена при моделировании структуры гомологичных белков. Примером рационального дизайна лекарств может служить разработка ингибиторов протеазы вируса иммунодефицита человека (HIV) (Erickson et aL, 1990). Кроме того, пептиды могут быть анализированы в аланиновом тесте (Wells, 1991). Согласно данному методу остаток аминокислоты заменяют на Ala и определяют эффект такой замены на активность пептида. Таким образом анализируют каждую аминокислоту пептида для определения его важных областей.
Возможно также получение мишеньспецифических антител, отобранных в функциональном тесте, с последующим определением их кристаллической структуры. В принципе, этот подход может дать основную информацию для рационального дизайна лекарств.
Кристаллографии белков можно избежать получением антиидиотипических антител к функциональным, фармакологически активным антителам. Как двукратное зеркальное отражение, сайт связывания антиидиотипических антител должен являться аналогом оригинального рецептора. Затем антиидиотипические антитела можно использовать для идентификации и выделения пептидов из банков химически или биологически полученных пептидов. Отобранные пептиды служат основой для конструирования лекарств.
Таким образом, могут быть сконструированы препараты, которые имеют, например, повышенную активность MTS или стабильность, или действующие как ингибиторы, агонисты, антагонисты и др. активности MTS. Благодаря доступности клонированных последовательностей MTS, полипептид MTS может быть получен в количествах, достаточных для проведения таких аналитических процедур, как рентгеновская кристаллография. Кроме того, раскрытая в настоящем изобретении последовательность белка MTS позволяет использовать компьютерное моделирование вместе с рентгеновской кристаллографией или вместо нее.
Способы применения: генотерапия
Согласно данному изобретению предлагается способ восстановления функции MTS дикого типа в клетке, несущей мутантные аллели MTS. Восстановление такой функции должно супрессировать неопластический рост реципиентных клеток. Ген MTS дикого типа (или часть этого гена) может быть введен в клетку посредством вектора, обеспечивающего экстрахромосомальное персистирование гена в клетке. В этом случае ген будет экспрессироваться в клетке без интеграции в хромосому. Если фрагмент гена введен и экспрессирован в клетке, несущей мутантные аллели MTS, то этот фрагмент должен кодировать ту часть белка MTS, которая необходима для неопластического роста клетки.
Более предпочтительна такая ситуация, когда ген MTS дикого типа или его фрагмент введены в клетку таким способом, который обеспечивает рекомбинацию с имеющимся в клетке эндогенным мутантным геном MTS. Подобная рекомбинация требует двух рекомбинационных актов для коррекции мутантного гена MTS. Известны векторы как для введения генов с целью рекомбинации, так и для поддержания их в экстрахромосомном состоянии, и выбор подобных векторов достаточно широк. Такие методы введения ДНК в клетки как электропорация, кальций-фосфатная копреципитация и вирусная трансдукция хорошо известны и выбор конкретного метода введения находится полностью в компетенции исследователя. Клетки, трансформированные геном MTS дикого типа, могут служить модельной системой для изучения опухолевой ремиссии и терапевтических подходов, способствующих такой ремиссии.
Как уже обсуждалось ранее, ген MTS или его фрагмент могут быть использованы в генной терапии для увеличения количества продуктов экспрессии данных генов в опухолевых клетках. Подобный подход особенно применим как в случае раковых, так и предраковых клеток, в которых уровень полипептида MTS снижен по сравнению с нормальными клетками. Этот подход может применяться и для повышения уровня экспрессии MTS в тех опухолевых клетках, в которых мутантный ген экспрессирован на "нормальном" уровне, но продукт экспрессии не полностью функционален.
Генотерапия должна проводиться согласно общепринятым методам, например, как описано Фридменом в "Терапии генетических заболеваний", T.Friedman, ed. Oxford University Press (1991), pp. 105-121. Клетки из опухоли пациента должны быть первоначально проанализированы с использованием описанных выше методов для выяснения уровня продукции полипептида MTS в этих клетках. Подготавливается вирусный или плазмидный вектор, в котором копия гена MTS связана с элементами контроля экспрессии, и способный к репликации в опухолевых клетках. Приемлемые векторы описаны например в патенте США 5252479 и опубликованной заявке PCT WO 93/07282. Затем вектор вводят больному локально в опухоль или же системно, с тем чтобы он мог проникнуть в опухолевые клетки возможных метастазов. Если трансфицированный ген не встраивается на постоянной основе в геном каждой опухолевой клетки-мишени, лечение может периодически повторяться. Поскольку полипептиды MTS участвуют в контроле клеточного цикла, предпочтительно, чтобы ген MTS был введен вместе со своими собственными регуляторными элементами, чтобы избежать конститутивной экспрессии полипептидов MTS во всех клетках, которые получат этот ген в результате описанной процедуры.
Известные системы переноса генов могут быть использованы для осуществления заявленного изобретения в целях генотерапии. Эти системы включают как вирусные, так и невирусные методы переноса. Многие вирусы были использованы как векторы для доставки генов: паповавирусы (например, SV40, Madzak et al., 1992), аденовирус (Berkner, 1992; Berkner et al., 1988, Gorziglia and Kapikian, 1992; Quantin et al., 1992; Rosenfeild et al., 1992; Wilkinson et al. , 1992; Stratford-Perricaudet et al., 1990), вирус осповакцины (Moss, 1992), аденоассоциированный вирус (Muzyczka, 1992; Ohi et al., 1990), герпесвирусы, включая HSV и EBV (Margolskee, 1992; Johnson et al., 1992; Fink et al. , 1992; Breakfeild and Geller, 1987; Treese et al., 1990) и ретровирусы птичьего (Brandyopadhyay and Temin, 1984; Petropoulos et al., 1992), мышиного (Miller, 1992; Miller et al., 1985; Sorge et al., 1984; Mann and Baltimore, 1985; Miller et al., 1988) и человеческого происхождения (Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchschacher and Panganiban, 1992). Большинство методов генотерапии человека основано на применении инактивированных мышиных ретровирусов.
Известные на сегодня невирусные способы переноса генов включают такие химические подходы, как кальций-фосфатная копреципитация (Graham and van der Eb, 1973; Pellicer et al., 1980); механические методы, например микроинъекция (Anderson et al., 1980; Gordon et al., 1980; Brinster et al., 1981; Constantini and Lacy, 1981); перенос при слиянии мембран посредством липосом (Feigner et al., 1987; Wang and Huang, 1989; Kaneda et al., 1989; Stewart et al. , 1992; Nabel et al., 1990; Lim et al., 1992); прямой захват ДНК и перенос ДНК при помощи рецепторов (Wollf et al., 1990; Wu et al., 1991; Zenke et al., 1990; Wu et al., 1989b; Wollf et al., 1991; Wagner et al., 1990; Wagner et al. , 1991; Cotten et al., 1990; Curiel et al., 1991a; Curiel et al., 1991b). Вирусопосредованный перенос генов может быть комбинирован с прямым переносом генов in vivo при помощи липосом, что позволяет доставлять вирусные векторы в опухолевые клетки, а не в неделящиеся окружающие клетки.
Кроме того, клетки, продуцирующие ретровирусный вектор, могут быть инъецированы в опухоли (Culver et al., 1992), что создает постоянный источник вирусных частиц. Указанный метод был опробован на пациентах с неоперабельными опухолями мозга.
В подходе, комбинирующем биологические и физические методы переноса генов, плазмидная ДНК любого размера связывается с полилизинконъюгированными антителами, специфичными к аденовирусному гексоновому белку, и полученный комплекс соединяют с аденовирусным вектором. Затем этим тримолекулярным комплексом инфицируют клетки. Аденовирусный вектор обеспечивает эффективное связывание, интернализацию и деградацию эндосомы, прежде чем произойдет деградация связанной ДНК.
Показано, что комплексы ДНК/липосомы могут быть использованы для прямого переноса генов in vivo. При том что в случае стандартного метода приготовления липосом процесс переноса генов in vivo неспецифичен, доказаны перенос ДНК in vivo и экспрессия в опухолях, например при прямом введении in situ (Nabel, 1992).
Способы применения: пептидная терапия
Пептиды, имеющие активность MTS, могут быть доставлены в клетки с утраченными MTS аллелями или несущие мутантные MTS-аллели. Описаны последовательности белков MTS (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16). Белок можно получить экспрессией кДНК в бактериях, например с помощью известных векторов экспрессии. Альтернативно, MTS-полипептид можно экстрагировать из MTS-продуцирующих клеток млекопитающих. Кроме того, для синтеза MTS-белка можно применить подходы синтетической химии. Любой из указанных методов позволяет получить заявленный в настоящем изобретении препарат, состоящий из MTS-белка. Данный препарат в значительной степени свободен от примесей других белков человека. Эта цель наиболее просто достижима при синтезе in vitro и синтезе в микроорганизмах.
Активные молекулы MTS могут быть введены в клетки микроинъекцией или при помощи липосом. Некоторые из этих активных молекул могут захватываться клетками активно или путем диффузии. Внеклеточное применение продукта гена MTS может быть достаточным для оказания эффекта на рост опухоли. Доставка молекул с активностью MTS должна приводить к частичной реверсии неопластического состояния. Другие молекулы с активностью MTS (например, пептиды, лекарства или органические соединения) также могут быть использованы для достижения такой реверсии. Модифицированные пептиды, имеющие весьма сходную функцию, также применимы для пептидной терапии.
Способы применения: трансформированные хозяева
Клетки и животные, несущие мутантный аллель MTS, могут быть использованы в качестве модельных систем для изучения и проверки веществ, от которых можно ожидать потенциального терапевтического эффекта. Для культивирования обычно используют эпителиальные клетки. Соматические клетки или клетки зародышевой линии могут быть получены от пациентов с мутациями MTS.
Напротив, клеточная линия с мутацией MTS-аллеля может быть сконструирована, как описано выше. После того как проверяемое вещество добавлено к клеткам, определяют неопластический трансформированный фенотип клеток. Любой из параметров неопластической трансформации клеток, включая субстратнезависимый рост, туморогенность для голых мышей, инвазивность или зависимость от факторов роста, может быть охарактеризован. Методы для этого хорошо известны.
Животные для проверки терапевтических агентов могут быть отобраны после мутагенеза, осуществленного на целых животных, клетках зародышевой линии или же зиготах. Подобный мутагенез подразумевает введение мутантных аллелей MTS, обычно животного другого вида, или же введение поврежденных гомологичных генов. Напротив, эндогенный ген (гены) MTS животных может быть поврежден инсерцией или делецией или же введением других генетических повреждений при помощи известных методов (Capecchi, 1989; Valancius and Smithies, 1991; Hasty et al., 1991; Shinkai et al., 1992; Mombaerts et al., 1992; Philpott et al. , 1992; Snouwaert et al., 1992; Donehower et al., 1992). После введения животным проверяемых веществ должен контролироваться рост опухолей. Если проверяемые вещества предотвращают или подавляют рост опухолей, тогда эти вещества являются возможными кандидатами на роль терапевтических агентов в отношении указанных в настоящей заявке форм рака.
Настоящее изобретение иллюстрируют следующие примеры, которые ни в коей мере не ограничивают его применение. Использованы стандартные методы или методы, специально описанные ниже.
Пример 1. Материалы и методы
А. Генеалогия MTS
На фиг. 1A-1D показаны Родословные 3137, 3161, 3355 и 1771 соответственно. Частота заболеваний раком в этих родословных указана на чертежах. Во всех меланомах в родословной 3137 обнаружен чувствительный гаплотип, который встречался при анализе данной родословной и в опухолях другого происхождения.
Все меланомы в родословных 3161 и 3355 имели чувствительный гаплотип. Мутации MTS были идентифицированы в опухолях в родословной 1771.
В. Линии опухолевых клеток
Семьдесят шесть клеточных линий меланомы были получены из Людвиговского Онкологического Института (Memorial Sloan Kettering Cancer Center), 8 меланомных и 5 немеланомных клеточных линий были получены из Американской клеточной коллекции (АТСС).
С. Выделение и анализ ДНК из опухолевых клеточных линий
ДНК из опухолевых клеток выделяли, добавляя приблизительно к 10 миллионам клеток 3 мл лизирующего буфера (0.1 M NaCl; 0.1 М TrisHCl pH 8.0; 5 mM EDTA; 0.5% SDS). Смесь перемешивали на шейкере Vortex и инкубировали при 65oC 30 минут. Затем добавляли 0.5 мл 8 М KOAc, смесь перемешивали и инкубировали во
льду 30 минут. После центр