ИЗОБРЕТЕНИЕ
Патент Российской Федерации RU2262107
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗРЕЛОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ
Имя изобретателя: Чистякова Г.Н. (RU); Беломестнов С.Р. (RU); Тарасова М.Н. (RU)
Имя патентообладателя: Уральский НИИ охраны материнства и младенчества (RU)
Адрес для переписки: 620028, г.Екатеринбург, ул. Репина, 1, ГУ НИИ ОММ МЗ РФ пат.отд.
Дата начала действия патента: 2004.05.28
Изобретение относится к области медицины. Способ определения проводят по степени конденсации хроматина сперматозоидов на основе интенсивности флуоресценции ДНК сперматозоидов до и после принудительной деконденсации гепарином методом проточной цитометрии, с использованием в качестве флуорохрома этидия бромида. Проводят измерение флуоресценции ДНК на проточном цитофлуориметре в красной области спектра
(l=620 нм), используя программу CELLLQuest, скорость сортировки 300 клеток в секунду. Используя статистический метод Колмогорова-Смирнова, проводят сравнение гистограмм с определением индекса подобия двух кривых n. При изначальной максимальной конденсации хроматина, характерной для зрелых сперматозоидов, индекс подобия n будет высоким (>48,5). При низкой изначальной конденсации хроматина, характерной для незрелых сперматозоидов, индекс подобия n будет низким (<48,5). Способ обеспечивает точность определения.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике.
Аналоги
1. Flow cytometry-fluorescence measurements for characterizing
sperm (Ewenson et al.) [1]. При осуществлении данного
метода происходит распределение
сперматозоидов на группы в зависимости от
степени конденсации их хроматина, на что
указывает его способность связываться с
флуорохромом (акридиновым оранжевым). Метод
носит описательный характер, учитывается
число сперматозоидов с конденсированным
хроматином, но не выделяется степень
конденсации.
2. Изучение деконденсации хроматина
в сперматозоидах кролика (Кузнецова И.В.,
Лущиков С.Б., Кузнецов А.В.) [2]. Данный метод
предлагает количественную оценку процесса
деконденсации хроматина сперматозоидов,
происходящего под воздействием различных
реагентов. Метод носит описательный
характер, требует проведения сложного
преаналитического этапа и одновременного
применения сложных диагностических
аппаратов (электронный микроскоп,
спектрофлуориметр, люминесцентный
микроскоп).
Прототип
Прототипом предложенного способа
является метод Воробьевой О.А. и др. [3, 4].
Авторы оценивают степень конденсации
хроматина, сравнивая интенсивность
флуоресценции хроматина сперматозоидов до
и после принудительной деконденсации
гепарином. Однако четкий математический
анализ, необходимый для динамического
наблюдения за пациентом или для сравнения
разных пациентов, в данной методике
отсутствует.
Сущность изобретения
Цель изобретения заключается в
разработке способа определения зрелости
сперматозоидов путем оценки степени
конденсации хроматина сперматозоидов.
Способ осуществляют следующим
образом:
Проводят исследование эякулята,
полученного способом мастурбации после 4-6-дневного
периода полового воздержания. Для
приготовления пробы в две пробирки,
содержащие по 100 мкл спермы, добавляют по 500
мкл трис-буфера, пробирки центрифугируют 10
мин при 2000 об/мин, после чего удаляют
надосадочную жидкость и осадок
ресуспендируют в 250 мкл трис-буфера. В обе
пробирки добавляют по 500 мкл детергента,
содержащего тритон Х-100, и непрерывно
встряхивают 30 секунд. В одну из пробирок
добавляют 50 мкл гепарина (5000 ед/мл),
инкубируют 20 мин при комнатной температуре.
Добавляют в обе пробирки по 1500 мкл
нитратного буфера и по 1 мкл этидия бромида.
Измеряют флуоресценцию ДНК на
проточном цитофлуориметре в красной
области спектра (l=620
нм), используя программу CELLQuest. Скорость
сортировки составляет 300 клеток в секунду.
Степень конденсации хроматина
сперматозоидов характеризуют гистограммы
распределения клеток до и после обработки
гепарином. Сравнение гистограмм проводят,
используя статистический метод
Колмогорова-Смирнова с определением
индекса подобия двух кривых n.
При изначальной максимальной
конденсации хроматина, характерной для
нормальных зрелых сперматозоидов,
насильственная деконденсация гепарином
приведет к значительным изменениям
флуоресценции ДНК, кривые на графике будут
значительно различаться и показатель n
будет высоким. При аномальной организации
структуры хроматина сперматозоидов
насильственная деконденсация приводит к
меньшим изменениям флуоресценции ДНК и
показатель n будет низким.
Установлено, что значение n>48,5
свидетельствует о зрелом состоянии
сперматозоидов (норма), а значение n<48,5
характеризует незрелость сперматозоидов (патология).
Пример 1. Мартынов С.В. проходил
обследование по поводу бесплодного брака.
При первом обследовании выявлена
астенотератозооспермия, показатель n
составил - 24,7 (65/03 от 2.10.03), что характеризует
незрелость сперматозоидов. Проведено
лечение, после которого результаты
спермограммы соответствуют
нормозооспермии, показатель n=62,69 (8/04 от
29.01.04), что характеризует зрелое состояние
сперматозоидов. В настоящее время супруга
Мартынова С.В. беременна.
Пример 2. Зубарев В.М., проходит
обследование по поводу бесплодного брака.
При первом обследовании выявлена
астенотератозооспермия, показатель n
составил 19,3 (от 08.04.03). Проведено лечение,
после которого результаты спермограммы
соответствуют нижним границам нормы, а
показатель n=24,27 (720/03 от 16.10.03). Назначен
повторный курс лечения.
Примеры показывают, что индекс
подобия двух кривых интенсивности
флуоресценции ДНК сперматозоидов n может
служить дополнительным критерием для
диагностики и оценки качества лечения
пациента. Достоверно установлено, что при n
большем 48,5 состояние сперматозоидов
соответствует норме, а при n меньшем 48,5
состояние сперматозоидов незрелое,
пациенту требуется лечение.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. U.S. Patent, Date of patent: Dec. 17, 1985. Patent Number:
4559309.
2. Кузнецова И.В., Лущиков С.Б.,
Кузнецов А.В. Изучение деконденсации
хроматина в сперматозоидах кролика.
Проблемы репродукции, 4, 1995, 8-12.
3. Воробьева О.А., Филатов М.В.,
Леонтьева О.А., Семенова Е.В. Влияние
аномальной организации хроматина
сперматозоидов на развитие эмбрионов
человека. Проблемы репродукции, 4, 1997, 23-26.
4. Воробьева О.А., Филатов М.В.,
Леонтьева О.А. Влияние аномальной
организации хроматина сперматозоидов на
развитие эмбрионов человека. Проблемы
репродукции, 1, 1998, 14-18.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ определения зрелости
сперматозоидов путем оценки степени
конденсации хроматина сперматозоидов при
исследовании эякулята, отличающийся тем,
что сравнивают интенсивность
флуоресценции ДНК сперматозоидов до и
после насильственной деконденсации
хроматина гепарином посредством
статической обработки методом Колмогорова-Смирнова
с определением индекса подобия кривых
интенсивности флуоресценции n, при значении
которого меньше 48,5 судят о незрелом
состоянии сперматозоидов, а при значении n
больше 48,5 судят о зрелости сперматозоидов.
Версия для печати
вверх
|
