ИЗОБРЕТЕНИЕ
Патент Российской Федерации RU2276357
(14) Дата публикации: 2006.05.10
(21) Регистрационный номер заявки: 2004118386/15
(22) Дата подачи заявки: 2004.06.17
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.06.17
(43) Дата публикации заявки: 2005.11.20
(45) Опубликовано: 2006.05.10
(56) Аналоги изобретения: Панкова Е.О. Современные подходы к диагностике и лечению гнойно-септических заболеваний женских половых органов, Вест. Росс. ассоц. акушгинек., 2001, №1, с.32-33. RU 2104529 C1, 10.02.1998. SU 1521458 C1, 15.11.1989. SU 1763980 A1, 23.09.1992.
(72) Имя изобретателя: Соловьев Евгений Владимирович (RU); Пальчик Елена Анатольевна (RU)
(73) Имя патентообладателя: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурская государственная медицинская академия МЗ РФ (RU)
(98) Адрес для переписки: 675000, Амурская обл., г.Благовещенск, ул. Горького, 95, ГОУ ВПО АГМА МЗ РФ, ПИО
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПОСЛЕРОДОВОГО ЭНДОМЕТРИТА
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для ранней диагностики послеродового эндометрита у родильниц после самостоятельного родоразрешения.
Известен способ диагностики гнойно-септических заболеваний, включающий комплексное обследование больных для определения значимых критериев и оценку тяжести эндогенной патологии [2].
Однако известный способ не позволяет в достаточной мере оценить степень тяжести эндогенной патологии.
Известно, что в патогенезе многих воспалительных заболеваний важная роль принадлежит состоянию кинин-калликреиновой системы плазмы крови (ККС) [2].
Предложен способ диагностики послеродового эндометрита у рожениц после самостоятельного родоразрешения путем исследования показателей кинин-калликреиновой системы, таких как спонтанная экстеразная активность, прекалликреин, ингибитор калликреина. Диагностика послеродового эндометрита осуществлялась при показателях спонтанной экстеразной активности выше 25,29 мкМ, прекалликреина ниже 49,28 мкМ и ингибитора каллиреина ниже 0,55 условных единиц.
Способ осуществляется следующим образом.
У 70 родильниц после самостоятельного родоразрешения исследовалась кинин-калликреиновая система плазмы крови. Диагностика осуществлялась на основе оценки параметров спонтанной экстеразной активности, прекалликреина, ингибитора калликреина. Если у здоровых родильниц с неосложненным течением послеродового периода показатель спонтанной экстеразной активности был 18,04 мкМ, прекалликреина 70,52 мкМ, ингибитора калликреина 0,72 у.е., то у родильниц с эндометритом показатель спонтанной экстеразной активности был достоверно выше 25,29±1,05 мкМ, прекалликреина ниже 49,28±1,62 мкМ, ингибитора калликреина ниже 0,55±0,021 у.е.
Диагнозы подтверждались данными УЗИ малого таза.
Показатели ККС определяетесь в плазме крови у родильниц хроматографическим методом определения активности калликреина в плазме крови человека [3]. Метод основан на определении экстеразной активностии калликреина по скорости гидролиза N-бензоил-L-аргинин-этилового эфира (БАЭЭ) после определения фермента от других протеиназ, проявляющих подобную активность, путем фракционирования цельной сыворотки крови на колонке (1×20 см) из ДЭАЭ - сефадекса А - 50, уравновешенного 0,01 М фосфатным буфером рН 7.0. В этих условиях калликреин не собирается анионитом и его активность может быть определена по суммарной БАЭЭ - эстеразной активности неадсорбированной фракции, полученной при промывании колонки указанным буфером. Активность калликреина определяли по скорости гидролиза БАЭЭ. При этом образовывался бензоил-аргинин (БА), растворы которого имели при 253 нм большую оптическую плотность, чем растворы БАЭЭ.
1) Выделение калликреина из сыворотки (плазмы) крови путем хроматографии на ДЭАЭ - сефадексе А - 50. Густую суспензию ДЭАЭ - сефадекса А - 50, уравновешенного 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0, заливали в колонку размером 1×20 см и пропускали через нее при колоночных объема того же буфера со скоростью тока жидкости 15 мл/ч. 1 мл сыворотки (плазмы) крови разбавляли в 2 раза 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0 и осторожно вносили в колонку под небольшой слой (1,5-2 см) буфера. Неадсорбированные на анионите белки вытесняли пропусканием через колонку 30 мл исходного буфера со скоростью 15 мл/ч и собирали фракции по 3 мл. Измерение эстеразной активности калликреина в неадсорбированной фракции проводили не позднее чем через 1-1,5 часа после ее получения.
2) Измерение БАЭЭ - эстеразной активности калликреина: сливали 2-5-е и 5-7-е фракции и измеряли БАЭЭ - эстеразную активность в объединенных фракциях спектрофотометрическим методом Траутшольда и Верле. Для этого 1 мл фракции разбавляли до 2 мл 0,05 М трис - HCl буфером рН 8,0, добавляли 1 мл 1,5·10-3 М раствора БАЭЭ в том же буфере и измеряли оптическую плотность пробы при 253 нм против 15·10-3 M раствора БАЭЭ в трис HCl буфере. Измерение проводили течение 15 минут, делая отсчеты через 5 минут. Ход энзиматической реакции выражали графически, откладывая на оси абсцисс время, а на оси ординат - прирост оптической плотности, соответствующий количеству образовавшегося БА ( Е), т.е. разницу между величиной поглощения опытной пробы в данный момент (Et) и величиной первого отсчета (Е о).
3) Вычисление активности фермента: пользуясь линейной частью графика, вычисляли прирост оптической плотности в пробе за определенный промежуток времени и находили по калибровочной кривой соответствующее ему количество БА (эквивалентное количеству гидролизованного БАЭЭ). Затем делали пересчет для выражения активности фермента, за 1 минуту на 1 мл сыворотки крови. Также пользовались расчетным коэффициентом, полученным из следующих данных: если а - прирост оптической платности в пробе за 1 минуту ( Е253), то общая активность на пробу равна:
мкмоль БАЭЭ/мин, где 3 мл - объем пробы.
1,1 - разность оптической плотности для миллимолярных растворов БА и БАЭЭ.
Так как последняя величина и объем пробы постоянны, то расчетная формула принимает вид: а·2,73 мкмоль БАЭЭ/ мин в пробе.
4) Построение калибровочного графика для определения БА. Готовили серию растворов БА (Мr=278,3) и БАЭЭ в 0,05 М трис - HCl буфере рН 8,0, содержащих в 1 мл 0,05; 0,1; 0,2 и 0,3 мкмоль БА и БАЭЭ соответственно. Оптическую плотность этих растворов измеряли при 253 нм в кювете толщиной 1 см против 0,05 М трис - HCl буфера. Строили калибровочный график, откладывая на оси ординат разность в поглощении растворов БА и БАЭЭ одинаковой концентрации, а на оси абсцисс - количество БА (или БАЭЭ) в мкмоль/мл.
Проведена сравнительная оценка показателей ККС у родильниц с эндометритом и у женщин с неосложненным течением послеродового периода, данные представлены в таблице.
Клиническая группа Кол-во б-х Спонтанная эстеразная активность, мкМ Прекалликреин, мкМ Ингибитор калликреина, усл.ед.
1. Здоровые родильницы 20 18,04±0,66 70,52-1,34 0,72±0,020
2. Эндометрит до лечения 50 25,29±1,05 49,28±1,62 0,55±0,021
p 1,2<0,01 p1,2 <0,001 p1,2<0,05
Пример 1. Больная К., 25 лет, послеродовое отделение гор. род. дом 20.08.99, ИБ №2672, с диагнозом «Поздний послеродовый период».
На 4-е сутки после родов проведена оценка показателей ККС (спонтанная эстеразная активность 26,10 мкМ. Прекалликреин 50,23 мкМ, ингибитор калликреина 0,59). На основании этих данных выставлен диагноз: Поздний послеродовый период. Вялотекущий эндометрит. Диагноз подтвержден данными УЗИ малого таза - эндометрит на 6-е сутки.
Пример 2. Больная Е., 20 лет, послеродовое отделение гор. род. дом 12.09.99, ИБ №2793, с диагнозом «Поздний послеродовый период».
На 4-е сутки после родов предъявляла жалобы на повышение температуры до 38°С. Проведена оценка показателей ККС (спонтанная эстеразная активность 27,26 мкМ, Прекалликреин 51,13 мкМ, ингибитор калликреина 0,51). Па основании этих данных выставлен диагноз: Поздний послеродовый период. Подострый эндометрит. Через сутки диагноз был подтвержден данными УЗИ малого таза - эндометрит.
Таким образом, предложенный способ диагностики послеродовых эндометритов (по определению показателей ККС) позволяет провести раннюю диагностику осложнения послеродового периода (в среднем на 4 сутки) до изменений определяемых по данным УЗИ.
Источники информации
1. Киселев В.И. Некоторые механизмы (функционирования кинин-калликреиновой системы плазмы крови и их роль в регуляции эффективности миотропных брадикининэргических реакций: Автореф. дисс. ... д-ра. мед. наук. - Томск, 1981.
2. Панкова Е.О. Современные подходы к диагностике и лечению гнойно-септических заболеваний женских половых органов // Вест. Росс. ассоц. акуш. - гинек. - 2001. - №1. - С.32-33.
3. Яровая ГА., Доценко В.Л., Пашинцева Л.П., Нартикова В.Ф., Пасхина Т.С. Методы клинической биохимии. Под редакцией АМН СССР Ореховича В.Н. Утверждено Редакционным советам ЦОЛИУВ в качестве учебного пособия. - Москва, 1982.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ диагностики послеродового эндометрита у родильниц после самостоятельного родоразрешения, характеризующийся тем, что исследуют показатели кинин-калликреиновой системы и при показателе спонтанной экстеразной активности 24,24-26,34 мкМ, прекалликреина 47,66-50,9 мкМ и ингибитора калликреина 0,529-0,571 условных единиц диагностируют послеродовой эндометрит.
