СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ-КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ-КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА


RU (11) 2013374 (13) C1

(51) 5 C01G7/00, B01J13/00 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 20.11.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(21) Заявка: 5049681/26 
(22) Дата подачи заявки: 1992.06.26 
(45) Опубликовано: 1994.05.30 
(71) Заявитель(и): Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН 
(72) Автор(ы): Богатырев В.А.; Дыкман Л.А.; Щеголев С.Ю. 
(73) Патентообладатель(и): Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ-КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА 

Использование: в коллоидной и неорганической химии золота, электронномикроскопических исследованиях в биологии и медицине. Сущность способа: в водный раствор золотохлористоводородной кислоты с рН 6,5 вводят динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты. Затем восстанавливают золото введением борогидрида натрия. Коньюгацию осуществляют по известным методикам. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к коллоидной и неорганической химии золота и применимо в электронномикроскопических и твердофазных методах исследования в биологии и медицине.

Известен способ, по которому при создании маркеров золи золота получают восстановлением золотохлористоводородной кислоты ЗХВК динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-Na2). По этому способу: 100 мл раствора ЭДТА-Na2 с концентрацией 3 х 10-4 М смешивают с 5 мл 0,05 N раствора карбоната калия и доводят до кипения в колбе с обратным водяным холодильником; в кипящий раствор добавляют 1 мл 1% водного раствора ЗХВК и интенсивно перемешивают.

Таким образом получают золи золота с диаметром частиц 20 нм [1] . Затем проводят приготовление маркера по методике [2,3] .

Недостатком этого способа является невозможность получения маркеров с частицами золота диаметром менее 20 нм. Также известен способ, по которому для получения маркеров с размерами частиц золота 3-17 нм, используют восстановление ЗХВК.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, по которому при создании маркеров для синтеза гидрозолей золота, пригодных для конъюгации с биомакромолекулами, используют восстановление ЗХВК борогидридом натрия. Согласно этому способу: к 40 мл бидистиллированной воды добавляют 150 мкл 4% водного раствора ЗХВК и 200 мкл 0,2 М карбоната калия; затем порциями по 400 мкл (обычно 3-5) добавляют свежеприготовленный 0,05% водный раствор борогидрида натрия при интенсивном перемешивании до тех пор, пока раствор не станет оранжево-красным [4] , после чего золь используют для приготовления маркера [2,3] или хранят на холоду в плотно закрытых флаконах из темного стекла.

Недостатками данного способа являются: невысокая степень воспроизводимости размеров частиц маркеров, малая стабильность золей при хранении.

Целью изобретения является повышение качества препаратов за счет воспроизводимой однородности в области малых размеров частиц, и следовательно, стабильности маркера.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения биоспецифических маркеров-конъюгатов коллоидного золота, включающем синтез золей золота химическим восстановлением ЗХВК борогидридом натрия и конъюгацию их с макромолекулами, синтез золей золота осуществляют в присутствии борогидрида натрия и ЭДТА-Na2 при комнатной температуре, причем ЭДТА-Na2 вводят до борогидрида натрия.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом: к 50 мл 0,01% водного раствора ЗХВК (в реакционную смесь может быть добавлен 0,2 М раствор карбоната калия для достижения рН, необходимого для дальнейшей конъюгации) при интенсивном перемешивании сначала добавляют ЭДТА-Na2 (3-3,5 х 10-4 м), а затем 0,5 мл 0,1% раствора борогидрида натрия; образуется золь оранжево-красного цвета.

О размере частиц золота судят по величине и положению максимума спектральной зависимости оптической плотности, определяемых с помощью стандартного спектрофотометра [3] .

Затем определяют минимальное защитное количество биополимера (зонда), необходимое для стабилизации золя золота (золотое число). Стабильным считается золь, не изменяющий цвета при добавлении хлорида натрия до концентрации 1% [2,3] .

Далее проводят конъюгацию золота с зондом, количество которого определяют исходя из золотого числа простым смешиванием на магнитной мешалке. Через 2-3 мин вносят вторичный стабилизатор (полиэтиленгликоль) до концентрации 0,02% .

Концентрирование проводят либо центрифугированием, либо диализом против полиэтиленгликоля. Затем фракционируют препараты центрифугированием в градиенте концентрации глицерина или с помощью гель-фильтрации. Отобранные фракции подвергают спектрофотометрическому контролю, доводят до оптической плотности Д(520)= 5,0 и разливают по аликвотам для хранения и использования.

П р и м е р. Синтез биоспецифического маркера стрептавидин + коллоидное золото 5 нм. К 50 мл 0,01% водного раствора ЗХВК добавляют 0,2 мл 0,2 М раствора карбоната калия для достижения рН = 6,5 - оптимального значения для дальнейшей конъюгации. К полученному раствору добавляют 5,5 мг (3 10-4м ) ЭДТА-Na2 и тщательно перемешивают на магнитной мешалке. Затем, увеличив обороты мешалки, вносят 0,5 мл 0,1% раствора борогидрида натрия. Практически мгновенно образуется золь оранжево-красного цвета.

Максимум спектральной зависимости оптической плотности определяется с помощью спектрофотометра. Максимум составляет 513 нм, что по теории Ми соответствует диаметру золотых частиц 5 нм.

Дальнейшие операции проводят согласно [2,3] . 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ-КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА, включающий восстановление раствора золотохлористоводородной кислоты борогидридом натрия при комнатной температуре и конъюгацию полученного золя золота с макромолекулами, отличающийся тем, что перед восстановлением в раствор золотохлористоводородной кислоты вводят динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты.


ПРОЧИТАТЬ НУЖНО ВСЕМ !
Судьба пионерских изобретений и научных разработок, которым нет и не будет аналогов на планете еще лет сорок, разве что у инопланетян

Независимый научно технический портал
Устройства и способы извлечения цветных, редкоземельных и благородных металлов






СОВЕРШЕННО БЕСПЛАТНО!
Вам нужна ПОЛНАЯ ВЕРСИЯ данного патента? Сообщите об этом администрации портала. В сообщении обязательно укажите ссылку на данную страницу.


ПОИСК ИНФОРМАЦИИ В БАЗЕ ДАННЫХ


Режим поиска: "и" "или"

Инструкция. Ключевые слова в поле ввода разделяются пробелом или запятой. Регистр не имеет значения.

Режим поиска "И" означает, что будут найдены только те страници, где встречается каждое из ключевых слов. При использовании режима "или" результатом поиска будут все страници, где встречается хотя бы одно ключевое слово.

В любом режиме знак "+" перед ключевым словом означает, что данное ключевое слово должно присутствовать в найденных файлах. Если вы хотите исключить какое-либо слово из поиска, поставьте перед ним знак "-". Например: "+извлечение -золота".

Поиск выдает все данные, где встречается введенное Вами слово. Например, при запросе "золото" будут найдены слова "золотой", "золотое" и другие. Восклицательный знак после ключевого слова означает, что будут найдены только слова точно соответствующие запросу ("золото!").




Рейтинг@Mail.ru