СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ-КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ-КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА


RU (11) 2013374 (13) C1

(51) 5 C01G7/00, B01J13/00 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 20.11.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(21) Заявка: 5049681/26 
(22) Дата подачи заявки: 1992.06.26 
(45) Опубликовано: 1994.05.30 
(71) Заявитель(и): Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН 
(72) Автор(ы): Богатырев В.А.; Дыкман Л.А.; Щеголев С.Ю. 
(73) Патентообладатель(и): Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ-КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА 

Использование: в коллоидной и неорганической химии золота, электронномикроскопических исследованиях в биологии и медицине. Сущность способа: в водный раствор золотохлористоводородной кислоты с рН 6,5 вводят динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты. Затем восстанавливают золото введением борогидрида натрия. Коньюгацию осуществляют по известным методикам. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к коллоидной и неорганической химии золота и применимо в электронномикроскопических и твердофазных методах исследования в биологии и медицине.

Известен способ, по которому при создании маркеров золи золота получают восстановлением золотохлористоводородной кислоты ЗХВК динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-Na2). По этому способу: 100 мл раствора ЭДТА-Na2 с концентрацией 3 х 10-4 М смешивают с 5 мл 0,05 N раствора карбоната калия и доводят до кипения в колбе с обратным водяным холодильником; в кипящий раствор добавляют 1 мл 1% водного раствора ЗХВК и интенсивно перемешивают.

Таким образом получают золи золота с диаметром частиц 20 нм [1] . Затем проводят приготовление маркера по методике [2,3] .

Недостатком этого способа является невозможность получения маркеров с частицами золота диаметром менее 20 нм. Также известен способ, по которому для получения маркеров с размерами частиц золота 3-17 нм, используют восстановление ЗХВК.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, по которому при создании маркеров для синтеза гидрозолей золота, пригодных для конъюгации с биомакромолекулами, используют восстановление ЗХВК борогидридом натрия. Согласно этому способу: к 40 мл бидистиллированной воды добавляют 150 мкл 4% водного раствора ЗХВК и 200 мкл 0,2 М карбоната калия; затем порциями по 400 мкл (обычно 3-5) добавляют свежеприготовленный 0,05% водный раствор борогидрида натрия при интенсивном перемешивании до тех пор, пока раствор не станет оранжево-красным [4] , после чего золь используют для приготовления маркера [2,3] или хранят на холоду в плотно закрытых флаконах из темного стекла.

Недостатками данного способа являются: невысокая степень воспроизводимости размеров частиц маркеров, малая стабильность золей при хранении.

Целью изобретения является повышение качества препаратов за счет воспроизводимой однородности в области малых размеров частиц, и следовательно, стабильности маркера.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения биоспецифических маркеров-конъюгатов коллоидного золота, включающем синтез золей золота химическим восстановлением ЗХВК борогидридом натрия и конъюгацию их с макромолекулами, синтез золей золота осуществляют в присутствии борогидрида натрия и ЭДТА-Na2 при комнатной температуре, причем ЭДТА-Na2 вводят до борогидрида натрия.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом: к 50 мл 0,01% водного раствора ЗХВК (в реакционную смесь может быть добавлен 0,2 М раствор карбоната калия для достижения рН, необходимого для дальнейшей конъюгации) при интенсивном перемешивании сначала добавляют ЭДТА-Na2 (3-3,5 х 10-4 м), а затем 0,5 мл 0,1% раствора борогидрида натрия; образуется золь оранжево-красного цвета.

О размере частиц золота судят по величине и положению максимума спектральной зависимости оптической плотности, определяемых с помощью стандартного спектрофотометра [3] .

Затем определяют минимальное защитное количество биополимера (зонда), необходимое для стабилизации золя золота (золотое число). Стабильным считается золь, не изменяющий цвета при добавлении хлорида натрия до концентрации 1% [2,3] .

Далее проводят конъюгацию золота с зондом, количество которого определяют исходя из золотого числа простым смешиванием на магнитной мешалке. Через 2-3 мин вносят вторичный стабилизатор (полиэтиленгликоль) до концентрации 0,02% .

Концентрирование проводят либо центрифугированием, либо диализом против полиэтиленгликоля. Затем фракционируют препараты центрифугированием в градиенте концентрации глицерина или с помощью гель-фильтрации. Отобранные фракции подвергают спектрофотометрическому контролю, доводят до оптической плотности Д(520)= 5,0 и разливают по аликвотам для хранения и использования.

П р и м е р. Синтез биоспецифического маркера стрептавидин + коллоидное золото 5 нм. К 50 мл 0,01% водного раствора ЗХВК добавляют 0,2 мл 0,2 М раствора карбоната калия для достижения рН = 6,5 - оптимального значения для дальнейшей конъюгации. К полученному раствору добавляют 5,5 мг (3 10-4м ) ЭДТА-Na2 и тщательно перемешивают на магнитной мешалке. Затем, увеличив обороты мешалки, вносят 0,5 мл 0,1% раствора борогидрида натрия. Практически мгновенно образуется золь оранжево-красного цвета.

Максимум спектральной зависимости оптической плотности определяется с помощью спектрофотометра. Максимум составляет 513 нм, что по теории Ми соответствует диаметру золотых частиц 5 нм.

Дальнейшие операции проводят согласно [2,3] . 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ-КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА, включающий восстановление раствора золотохлористоводородной кислоты борогидридом натрия при комнатной температуре и конъюгацию полученного золя золота с макромолекулами, отличающийся тем, что перед восстановлением в раствор золотохлористоводородной кислоты вводят динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты.